随着纳米技术的飞速发展，人工纳米材料作为一种性能优越的新兴材料被广泛应用于生产和生活中^[1]。在众多的纳米材料中，纳米二氧化钛(nano-TiO₂)用途广泛，其年产量位居世界第一^[2]。nano-TiO₂因其独特的性质，在催化剂、颜料、油漆、药品和化妆品等众多商品的生产中起到了重要的作用^[3-4]。nano-TiO₂用量大、应用范围广，增加了其入水体环境的风险。根据Gottschalk等的研究预测，与其他金属纳米材料相比，nano-TiO₂在表层水体中的浓度最高^[5]。大量的TiO₂纳米颗粒被用于生产防晒产品，约25%的防晒产品伴随人类游泳和海浴的过程进入到了海洋环境中，每年约有250 t的纳米材料通过此途径进入海洋环境^[6]。废弃的nano-TiO₂也会随着工业废水排入海洋，从而对海洋生态系统产生影响，对海洋生物构成潜在的威胁^[7]。

微藻作为海洋环境中的初级生产者，是海洋生物食物链不可或缺的一环，对于维持海洋生态平衡具有重要的意义。且微藻具有个体小，生长周期短，容易培养，对毒物较为敏感等优势，可作为一种模式生物研究污染物的毒性效应，以及评价污染物的生态风险(OECD 201; GB/T 21805-2008)。已有研究报道了nano-TiO₂对微藻的毒性效应，而部分研究认为nano-TiO₂的毒性较小，不会对海洋生物的健康构成威胁^[8-9]。但更多学者认为nano-TiO₂的毒性和潜在的环境风险应当引起人们的重视，它能造成细胞毒性和氧化损伤，甚至还会产生遗传毒性^[10-12]。Clément等研究表明nano-TiO₂会对浮游植物产生毒性作用，且锐钛矿型的nano-TiO₂的毒性大于金红石型nano-TiO₂，而nano-TiO₂毒性也远大于微米级的TiO₂^[10]。侯东颖等研究了nano-TiO₂对普生轮藻(Chara vulgaris L.)的毒性效应，测定微藻叶绿素含量，及氧化还原相关酶(超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等)的活性，结果表明nano-TiO₂可以降低酶活性和微藻叶绿素含量，对微藻产生一定的毒性^[12]。目前对于nano-TiO₂的致毒机理也存在一定的争议，部分研究认为物理作用贡献了其主要毒性，另外一些研究则认为nano-TiO₂诱导产生的活性氧簇(ROS)导致了细胞氧化损伤才是构成nano-TiO₂毒性的主要原因，所以nano-TiO₂的毒性效应仍需要进一步的探索^{[10, 13]}。

本文选取了两种海洋微藻中肋骨条藻(Skeletonema costatum)和杜氏盐藻(Dunaliella salina)开展微藻生长抑制实验，并测定微藻叶绿素的含量，探索nano-TiO₂对微藻生长和光合作用的抑制情况；利用扫描电镜观测微藻对nano-TiO₂的吸附作用，测定微藻的脂质过氧化水平，并初步研究nano-TiO₂的沉降效应，探讨nano-TiO₂的分散稳定性，分析nano-TiO₂的致毒机理，为nano-TiO₂潜在的环境风险评价提供数据支持。

1   材料与方法

1.1   实验药品

主要药品为nano-TiO₂，锐钛矿型，白色粉末，纯度为99.8%，平均粒径为60 nm，如图 1所示，生产厂家为阿拉丁试剂(上海)有限公司。其余试剂均为国药分析纯试剂。

图  1  nano-TiO₂的透射电镜表征

Fig.  1  TEM images of nano-TiO₂

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1.2   实验藻种及培养条件

实验用微藻为中肋骨条藻S.costatum，硅藻属和杜氏盐藻D.salina，绿藻属。本文选用的两种海洋微藻均取自中国海洋大学海洋污染生态化学实验室藻种室。取青岛周围海域海水(盐度30)经混合纤维滤膜(0.45 μm)过滤，于120℃高温高压下灭菌20 min，冷却至室温，加入营养盐、微量元素和维生素，配制成f/2培养基，两种微藻均培养在f/2培养基中。培养容器为5 L锥形瓶，放置于光照培养箱中，培养温度为20±1℃，光照采用冷白光源，光照强度4000 lx，光暗比为12 h:[KG-*2]12 h。每天定时摇晃2次，防止微藻沉淀，培养5~7 d于指数期时进行毒性实验。藻细胞密度采用血细胞计数板于倒置显微镜下计数，显微镜放大倍数为400倍。

1.3   nano-TiO₂悬浮液的制备

将nano-TiO₂粉末加入到milli-Q水中制备1000 mg/L储备液。实验时，将nano-TiO₂储备液用milli-Q水稀释至400、200和100 mg/L，于50 W超声条件下超声30 min待用。

1.4   nano-TiO₂沉降曲线测定

将nano-TiO₂粉末加入到f/2培养基中，摇匀超声使其充分悬浮，取适量上层nano-TiO₂悬浮液，测定其在320 nm波长下的吸光度，其吸光度和nano-TiO₂浓度成线性关系，工作曲线如图 2所示。测定100 mg/L nano-TiO₂悬浮液初始吸光度为A₀，随着时间的变化，取上层nano-TiO₂悬浮液测定吸光度为A，那么A/A₀就是存在于悬浮液中nano-TiO₂的比例。

图  2  悬浮液中TiO₂的浓度和吸光度(320 nm)的标准曲线

Fig.  2  Standard curve between TiO₂ concentration and absorbance

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1.5   微藻的生长抑制实验

微藻生长抑制实验参照OECD导则201进行。将100 mL预培养至指数期的藻液加入250 mL锥形瓶中，然后加入不同浓度nano-TiO₂稀释储备液，每组实验设有3个重复。为了方便不同藻种之间的毒性比较，每种微藻生长抑制实验中，nano-TiO₂的浓度均为0、5、10、20和50 mg/L。锥形瓶随机摆放在培养箱中，培养条件同1.2，培养时间为96 h。每天记录微藻密度，每个锥形瓶中的微藻计数3次，结果采用平均值±标准差的方式表示。

1.6   叶绿素含量测定

叶绿素的含量由基于荧光技术的藻类分析仪(bbe-Moldaenke, Germany)测定^[14]，用bbe藻类分析仪直接测定活体藻的叶绿素荧光值，取适量(约20 mL)藻液测定后倒回原锥形瓶摇匀，并重新随机放置培养瓶，以排除光照和温度对实验造成的影响。为了方便数据的比较，所有叶绿素的数据均转化为对照组的百分比(% control)。

1.7   扫描电镜样品的制备

采用扫描电镜技术观察两种微藻对nano-TiO₂的吸附作用。微藻在含10 mg/L nano-TiO₂培养基中暴露24 h，将藻液离心(3000 rpm, 10 min)收集藻细胞，向藻细胞中加入2.5%的戊二醛于4℃冰箱过夜。然后用0.1 mol/L磷酸缓冲液(PBS, pH=7.4)冲洗藻细胞样品3遍，每次冲洗完离心(3000 rpm, 10 min)弃掉上清液，保留底部样品。然后依次加入不同浓度的乙醇溶液(30%、50%、80%、90%和100%)进行样品梯度脱水，每步脱水持续20 min。脱水后的样品加入叔丁醇于4℃冰箱进行固定，冷冻干燥后涂布在导电胶上，上机观察。

1.8   脂质过氧化水平测定

脂质过氧化水平(丙二醛含量，MDA level)用于反映细胞膜被氧化的程度。选取微藻D.salina在10 mg/L nano-TiO₂的处理条件下，采用购买于南京建成生物工程研究所的MDA测定试剂盒(TBA法)测定96 h实验周期内藻细胞脂质过氧化水平变化情况。

1.9   数据处理与分析

采用单因素方差分析(Duncan’s multiple-range test)检验各个实验处理组之间显著性差异(p＜0.05)。实验结果均用平均值±标准差的形式表示。生长抑制率IR计算公式为：IR(%)=(1-T/C)×100%，式中：T为实验组微藻细胞密度；C为对照组微藻细胞密度。

2   结果与讨论

2.1   nano-TiO₂团聚沉降分析

在实验的过程中，发现nano-TiO₂在f/2培养基中具有较快的沉降速率，为了探索悬浮液中nano-TiO₂的存在量，测定了100 mg/L nano-TiO₂在培养基中的沉降曲线，如图 3所示。随着时间的增加，悬浮液中nano-TiO₂的含量不断减少，经过6 h的静置，悬浮液中nano-TiO₂颗粒浓度趋于稳定，维持在初始浓度10%左右。即使每天摇匀2次，nano-TiO₂的浓度也只能维持在初始浓度的60%，所以在进行nano-TiO₂的生态毒性实验时，真实的暴露浓度可能会低于设定的nano-TiO₂悬浮液的浓度。

图  3  nano-TiO₂在培养基中的沉降曲线

Fig.  3  Settlement of nano-TiO₂ dispersed in f/2 medium with 24 h

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2.2   nano-TiO₂对微藻生长抑制作用

为了方便比较nano-TiO₂对两种微藻的毒性大小，采用生长抑制率IR代替微藻细胞密度，评估nano-TiO₂对海洋微藻的毒性效应。如图 4所示，两种微藻的生长均受到nano-TiO₂的抑制，抑制情况略有不同。如图 4A所示，随着nano-TiO₂的浓度增加，暴露时间的增加，S.costatum的IR不断增大。经过96 h暴露，在50 mg/L nano-TiO₂处理浓度下，S.costatum的IR达到最大值(50.1%)。但是在5 mg/L和10 mg/L低浓度nano-TiO₂的处理条件下，经过24 h暴露处理，S.costatum的IR与对照组没有显著性差异(p>0.05)。此外，在5 mg/L nano-TiO₂的处理条件下，48 h和72 h的S.costatum的IR也没有显著性差异(p>0.05)。

图  4  96 h生长抑制实验中，不同浓度nano-TiO₂对两种海洋微藻的生长抑制率

Fig.  4  Growth inhibition ratios of two algae after exposure to different concentrations of nano-TiO₂ at 24 h, 48 h, 72hand 96 h

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D.salina的实验结果和S.costatum的相似，如图 4B所示。随着nano-TiO₂的浓度增加，暴露时间的增加，D.salina的IR也不断增大。经过96 h暴露，在50 mg/L nano-TiO₂处理浓度下，D.salina的IR达到最大值(46.7%)。与S.costatum的结果略有不同的是，在5和10 mg/L nano-TiO₂的浓度条件下，经过24 h暴露处理，D.salina的IR就与对照组有显著性差异(p＜0.05)。此外，在5 mg/L nano-TiO₂的处理条件下，48 h、72 h和96 h的D.salina的IR与对照组相比均没有显著性差异(p > 0.05)。虽然实验初期D.salina对nano-TiO₂的处理较为敏感，但总体来看，两种微藻的IR变化趋势一致，且两种微藻间的最大生长抑制率没有显著性差异(独立样品t检验，p>0.05)。nano-TiO₂对两种微藻的毒性大小相似。

虽然本文中nano-TiO₂对两种微藻的毒性大小相似，即经过96 h的实验，在最高浓度50 mg/L nano-TiO₂暴露条件下，对微藻的IR均约为50%。但在之前的研究中，Wang等发现nano-TiO₂(15 nm)对三角褐指藻(Phaeodactylum tricomutum)的96 h-EC₅₀(半数效应浓度)为203.74 mg/L^[15]，Lin等研究发现nano-TiO₂(5~10 nm)对小球藻(Chlorella sp.)的96 h-EC₅₀为4.9 mg/L^[16]，表明对于不同的藻种，nano-TiO₂的毒性差异较大。即使对于相同藻种S.costatum，Li等研究发现nano-TiO₂(5~10 nm)对S.costatum的72 h-EC₅₀的为7.37 mg/L^[13]，可见不同粒径的nano-TiO₂，[JP2]培养基及实验条件对实验结果都有显著影响^[17]。这也表明对于纳米颗粒的毒性测试，需要有统一的规范标准，以及对纳米颗粒毒性敏感的模式藻种，才有利于进行纳米颗粒的环境风险和生态风险评估。

本文探索了nano-TiO₂对微藻叶绿素含量的影响，结果表明nano-TiO₂会影响微藻的光合作用。如图 5所示，在10和50 mg/L nano-TiO₂的处理条件下，nano-TiO₂会降低微藻叶绿素的含量，随着时间的增加，叶绿素含量不断降低。50 mg/L nano-TiO₂对微藻叶绿素含量的影响要大于10 mg/L nano-TiO₂。如图 5A所示，除了24 h，10 mg/L nano-TiO₂处理条件下，微藻S.costatum的叶绿素含量与对照组没有显著性差异(p>0.05)，其余时间与处理浓度下叶绿素含量均与对照组有显著性差异(p＜0.05)。对于微藻D.salina而言，在各个时间点和处理浓度下，其叶绿素含量均与对照组有显著性差异(p＜0.05)，如图 5B所示。

图  5  在10和50 mg/L nano-TiO₂处理条件下，两种微藻叶绿素含量随时间的变化情况(*代表和对照组有显著性差异，p＜0.05)

Fig.  5  The concentrations changes of chlorophyll concentration in two microalgae with time after exposure to 10 and 50 mg/L nano-TiO₂(* represents significant difference (p < 0.05) between the exposure group and the control (100%))

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与生长抑制实验结果相同，nano-TiO₂会降低两种微藻的叶绿素含量，进而对微藻的光合作用产生影响。侯东颖等研究了纳米TiO₂胁迫对普生轮藻(Chara vulgaris L.)的毒性效应，结果发现随着TiO₂浓度和暴露时间的增加，微藻叶绿素含量显著降低，表现出剂量效应关系，并且在高浓度100 mg/L的处理条件下，抑制现象极为明显^[18]。Iswarya等研究也表明，在紫外光照射条件下，即使在极低的纳米TiO₂浓度(0.25 mg/L)条件下，也会显著降低小球藻(Chlorella sp.)的叶绿素含量，阻碍微藻细胞的生长^[11]。总的来说，不论是对微藻的生长还是光合作用，nano-TiO₂均产生了毒性抑制效应。

2.3   微藻对nano-TiO₂的吸附作用

D.salina在低浓度暴露实验中就对nano-TiO₂的毒性效应较为敏感，所以选取D.salina作为研究对象，利用扫描电镜技术观察了其对nano-TiO₂的吸附作用。如图 6所示，D.salina藻细胞成球形，表面光滑。经nano-TiO₂处理后，在D.salina的表面可以观察到吸附的nano-TiO₂。nano-TiO₂会在f/2培养基中发生团聚，团聚后的nano-TiO₂依然可以附着在D.salina的表面。虽然没有报道说明包裹的nano-TiO₂可以释放钛离子对微藻造成损伤，但包裹的nano-TiO₂同样会对微藻产生物理损伤。例如，在Wang等的研究中，nano-TiO₂会附着和包裹三角褐指藻(P.tricornutum)，造成微藻细胞壁的破裂，从而使nano-TiO₂进入藻细胞，直接危害微藻的生长和光合作用^[15]。在Li等的研究中，10 mg/L的TiO₂纳米颗粒就能包裹整个腰鞭毛藻(Karenia brevis)细胞，并且完全抑制微藻的生长，甚至可以进入到微藻的叶绿体中危害微藻的光合作用^[13]。这些包裹的nano-TiO₂隔绝了营养物质的输送，干扰了微藻细胞的移动，也会对微藻的生长产生抑制^[7]。本实验样品制备过程中，除盐和脱水过程中PBS和乙醇溶液可能会冲洗掉部分nano-TiO₂，所以最终观察结果中被吸附的nano-TiO₂的量可能会低于样品制备之前的量。

图  6  在10 mg/L nano-TiO₂处理条件下，D.salina对nano-TiO₂的吸附作用(A:未经nano-TiO₂处理的对照组，B:nano-TiO₂处理组)

Fig.  6  SEM images of the adsorption of nano-TiO₂ on D.salina withatreatment of 10 mg/L of nano-TiO₂ after 24hexposure(A:control without treatment, B:nano-TiO₂ treatment)

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2.4   nano-TiO₂对微藻的脂质过氧化损伤

脂质过氧化损伤是细胞氧化损伤的一种，可以指示细胞膜氧化损伤的程度，本文采用MDA水平来反映脂质过氧化水平。如图 7所示，在10 mg/L和50 mg/L nano-TiO₂的处理条件下，随着时间的增加，微藻D.salina的MDA水平不断增加，在最初24 h处理时间内，就与对照组有显著性差异(p＜0.05)。50 mg/L nano-TiO₂的处理条件下，微藻MDA的水平高于10 mg/L nano-TiO₂的处理条件。浓度高的nano-TiO₂对微藻造成的脂质过氧化损伤较大，与微藻生长抑制的实验结果一致。侯东颖等研究探明，采用0~100 mg/L TiO₂纳米颗粒悬浮液处理微藻，随着暴露时间的增加，超氧化物歧化酶SOD和过氧化氢酶CAT的活性逐渐降低，而MDA的水平显著增加，与本文结果一致^[12]。而Li等的研究更是认为，用平均粒径为5~10 nm的nano-TiO₂处理微藻，ROS水平显著增加，随着nano-TiO₂浓度和暴露时间的增加，ROS还会在细胞内不断积累，破坏了微藻的抗氧化系统，对细胞生长和光合作用产生抑制，最终氧化损伤积累还会造成细胞的死亡^[13]。

图  7  10和50 mg/L nano-TiO₂诱导条件下，微藻细胞MDA水平变化(*代表与对照组具有显著性差异，p＜0.05)

Fig.  7  The level of MDA in microalgae after nano-TiO₂ treatment in microalgae at 24, 48, 72 and 96 h(*representsasignificant difference of p < 0.05 when compared to the control)

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虽然nano-TiO₂用于生产防晒产品，具有遮光作用，但Aruoja等研究表明即使在高浓度100 mg/L nano-TiO₂处理条件下，也可以忽略遮光作用对微藻Pseudokirchneriella subcapitata生长的影响^[19]。本文采用同样的遮光装置测定最高浓度为50 mg/L nano-TiO₂的遮光效应对微藻的影响，结果表明，在本实验设定的nano-TiO₂浓度范围内，遮光效应不影响光合作用和微藻的生长。

综上所述，nano-TiO₂会被微藻吸附，对微藻产生氧化损伤，抑制微藻的生长和光合作用，对微藻产生毒性效应。

3   结论

(1) nano-TiO₂对中肋骨条藻S.costatum和杜氏盐藻D.salina的生长和光合作用均有抑制，对两者毒性大小相似。经96 h暴露，50 mg/L nano-TiO₂浓度处理下，nano-TiO₂对两种微藻的IR的最大值分别为50.1%和46.7%；

(2) nano-TiO₂会被微藻吸附，对微藻产生氧化损伤，抑制微藻的生长和光合作用，是nano-TiO₂对微藻产生毒性的主要原因；

(3) nano-TiO₂在实验过程中会发生沉降，减小了悬浮液的浓度，但仍然对微藻产生毒性效应。