极地地区常年酷寒、冻土、湖泊及海洋分布非常广泛，形成了独特的极地生态系统^[1]。北极地区蕴含着丰富的微生物种质资源，由于其特殊的地理、环境及气候条件，生存于其中的微生物大多有其特殊的代谢特征和生理生化特性，如嗜盐和耐冷特性^[2]。微生物在北极相对简单脆弱的生态系统中扮演着重要的角色，它们的分布情况可以敏锐地反映整个北极生态系统的变化，这个变化与温度密切相关。在过去的100 a中，北极温度升高速率几乎是全球平均速率的两倍^[3]。显著的气候变化将会影响生活在北极区域中的微生物多样性，为研究其在极地环境不同介质中群落结构的空间分布、多样性与周围环境因子的相互作用机制将需要长期大量的数据支持。

北极地区主要是海洋，其微生物多样性研究多集中在海洋^{[2, 4-7]}，此外，冰川^[8]、土壤^[9-10]和湖泊区域^[11]也有部分相关报道。如Bowman等^[7]发现北极海冰多年冰中的微生物类群主要是γ-变形菌(γ-Proteobacteria)和黄杆菌(Flavobacteria)，而北极海水中的微生物主要是α-变形菌(α-Proteobacteria)。北极土壤微生物受苔原影响较大，不同区域苔原植物的种类对微生物群落有重要的影响^{[9, 12]}。北极格陵兰岛地区(Greenland)的冰川、美国阿拉斯加Tooklik湖也是微生物多样性研究的热点区域^{[8, 11]}。我国科学家对海洋沉积物的微生物多样性研究表明，γ-变形菌为北极海底沉积物中优势菌群^{[2, 4-5]}。然而目前极地微生物多样性研究多针对单一环境介质，对极地微生物多样性空间异质性分布的系统研究更是缺乏。

北极斯瓦尔巴特群岛附近的新奥尔松地区由大峡湾、冰川、冰碛岩、冰川河流等地貌组成，其生态环境的复杂多样性为微生物提供了特殊的生存环境。为全面反映新奥尔松地区的可培养细菌多样性分布特征，本文采用可培养技术及16S rRNA基因序列测定技术，对来自于新奥尔松地区海洋、湖泊、河流的沉积物和土壤样品的微生物多样性进行分析，以期了解不同生境微生物群落结构特征及差异，为全面地认识环境多样性对微生物多样性的影响，同时也为合理利用及开发极地的微生物资源提供数据参考。

1   材料与方法

1.1   样品采集

样品来自于中国第四次北极科学考察(2010年7~9月)无菌药匙采集后置于无菌封口袋中，4℃低温保存，运回实验室进行菌株的分离培养。各采样点的样品类型及其它具体信息见表 1。

表  1  采样站位信息

Tab.  1  The information of station for sample collection

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1.2   培养基配置

选取下列四种培养基对土壤及沉积物的样品进行细菌培养。其中，湖泊沉积物、土壤样品和河流沉积物样品的培养基采用淡水配置，海洋沉积物样品的培养基采用陈海水配置，调整pH至7.4。

① LB培养基(用于菌种的分离及纯化保藏)：蛋白胨(1%，w/v)，酵母膏(0.5%，w/v)，琼脂(1.5%，w/v)，水1000 mL；

② Zobell 2216E培养基：蛋白胨(0.5%，w/v)，酵母膏(0.1%，w/v)，磷酸高铁(0.0025%，w/v)琼脂(2%，w/v)，水1000 mL；

③ ABM培养基：蛋白胨(0.5%，w/v)，酵母膏(0.2%，w/v)，琼脂(2%，w/v)，水1000 mL；

④ R2A培养基：酵母膏(0.05%，w/v)，酪蛋白胨(0.05%，w/v)，示蛋白胨(0.05%，w/v)，葡萄糖(0.05%，w/v)，可溶淀粉(0.05%，w/v)，丙酮酸钠(0.03%，w/v)，K₂HPO₄ (0.03%，w/v)，MgSO₄.7H2O (0.05%，w/v)，水1000 mL，琼脂(1.5%，w/v)。

1.3   可培养细菌的分离与纯化

将解冻后的2 g样品加入装有18 mL无菌生理盐水的三角瓶中，10℃下进行充分混匀及一系列的梯度稀释后，分别取100 μL在ABM、2216E、R2A、LB培养基上涂布，每个梯度设置3个平行，分别置于4℃和12℃下培养。培养2~4周后，根据菌落形态学特征，挑取形态差异较大的单菌落进行分离纯化及革兰氏染色鉴定。

1.4   分子鉴定与系统发育分析

将纯化后的细菌培养一段时间后，参照天根DNA提取试剂盒操作说明书进行DNA提取。采用细菌16S rRNA扩增通用引物27 F(5′-AGAGTTTGATCCT-GGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGT-TACGACTT-3′)进行PCR扩增。PCR扩增采用50 μL反应体系:1 μL引物27F (10 Cmol/L), 1 μL引物1492R (10 Tmol/L), 25 μL Master mix (KT201, 北京Tiangen), 21 μL无菌去离子水, 2 μL DNA模板。反应条件:94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 52℃ 30 s, 72℃ 1 min, 30个循环; 72℃ 10 min。PCR产物送到上海生工生物公司进行基因测序，测序结果在NCBI进行BLAST分析，一般认为，相似性在97%以上为同一种，95%以上为同一属，使用软件ClustalW校准对其多重比对，应用MEGA5.0软件，采用邻位相接法(Neighbour-Joining)构建系统发育进化树。

2   结果与讨论

2.1   可培养细菌形态及革兰氏染色结果

通过涂布及平板划线培养，对10个站位挑取的343个菌落从形态、颜色、大小等方面进行细菌形态学分析，共获得47株形态学特征差异较大的细菌，培养基中菌落形态多为圆形，颜色多以白色、乳白色为主，也有一些分泌黄色、橘色、淡粉色等色素的菌落。革兰氏染色结果显示47株代表性菌种中13株为革兰氏阳性菌，34株为革兰氏阴性菌，细胞形状多为球状，也有杆状、螺旋状等(图 1)。

图  1  部分可培养细菌的革兰氏染色结果

Fig.  1  Gram staining of respective isolates

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2.2   可培养细菌的分子鉴定

对纯化的47株代表性细菌进行16S rDNA的PCR反应，扩增出的基因片段平均长度约为1500 bp，将其16S rDNA序列测序结果登录到GenBank数据库进行Blast对比，与NCBI上已有序列进行相似性比较分析发现，46株与数据库中已有模式菌株的16S rDNA基因序列相似性达97%以上，只有1株细菌与已有模式菌的16S rRNA基因序列相似性低于97%。分子鉴定结果显示47株细菌归属于4个门，分别为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)，厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。6个纲，其中γ-变形菌纲的菌株数量最多，共27株，占总分离菌株数的57%，其次为芽孢杆菌纲(Bacilli)、α-变形菌纲(α-Proteobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)、黄杆菌纲(Flavobacteriia)和鞘脂杆菌纲(Sphingobacteria), 菌株数分别为9、5、4、1和1株，分别占总数的19%、11%、9%、2%和2% (表 2)。本结果与第六次北极科考采集的海洋沉积物中分离获得的可培养细菌在纲水平上的组成相同，优势类群均为γ-变形菌纲，且都比第五次北极科考海洋沉积物样品中多分离出鞘脂杆菌纲细菌^{[2, 4]}，这可能由于样品采集地点不同，同时表明极地微生物多样性分布可能存在地理差异。

表  2  47株可培养细菌的16S rDNA测序结果

Tab.  2  16S rDNA sequences results of 47culturable isolates

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在种属水平上，47株分离菌株分属于18个属和29个种。其中，芽孢杆菌纲细菌的多样性最为丰富，共6个属；γ-变形菌纲次之，共4个属；α-变形菌纲和放线菌纲各3个属，黄杆菌纲和鞘脂杆菌纲各仅含1个属。在菌株数量上，γ-变形菌纲属于优势类群，共27株，分属于13个种。其次为芽孢杆菌纲，共9株，分属于8个种。而第五次、第六次北极科考结果显示海洋沉积物分离细菌中均以γ-变形菌纲的多样性最为丰富，以希瓦氏菌属(Shewanella)所含菌株数量最多。希瓦氏菌属是典型的深海细菌类群之一，该菌属中绝大多数为嗜冷或耐冷的细菌。而本研究未在海洋沉积物样品中分离到希瓦氏菌属，这可能与采样地点或研究方法不同有关。

通过分析北极新奥尔松地区可培养细菌的分布情况发现，海洋沉积物样品中细菌多样性最为丰富，共11个属；其中，γ-变形菌纲中的嗜冷杆菌属(Psychrobacter)细菌数量最多，共5株(图 2)。海洋沉积物样品主要采自王湾，本研究结果表明湾内与湾外样品中细菌群落组成明显不同，考虑由于受大型冰川以及湾外大西洋的双重影响，特别是湾内盆地的淡水河沉积物输入，使海湾内环境条件的梯度变化明显，因而引起湾内向湾外微生物群落的明显变化。湖泊沉积物样品中细菌多样性次之，分属于6个属；其中，嗜冷杆菌属为优势类群，共18株细菌。另外，γ-变形菌纲、芽孢杆菌纲(Bacilli)和放线菌纲(Actinobacteria)是海洋沉积物和湖泊沉积物的共有菌群，而α-变形菌纲只出现在海洋沉积物中。芽孢杆菌纲是海洋沉积物、湖泊沉积物和河流沉积物中的共有类群，但在土壤样品中未被检测到。本文研究发现变形菌纲是北极奥尔松地区湖泊沉积物中的优势类群，这与其他学者研究结果相一致，如Wang等^[13]研究发现北极伦敦岛附近3个湖泊沉积物样品中变形菌纲和拟杆菌纲细菌是优势类群；Bahr等^[14]研究了美国阿拉斯加贫营养型湖Tooklik湖中的细菌后发现, 该湖中β-变形菌纲占绝对优势。Neufeld等^[15]研究表明变形菌门是北极苔原和森林土壤中最主要的细菌类群。杨晓^[16]对2013年、2015年中国北极黄河站科学考察采集的土壤样品进行可培养细菌多样性分析发现，该地区细菌的优势属为黄杆菌属(Flavobacterium)、节细菌属(Arthrobacter)和假单胞菌属(Pseudomonas)。这与本研究土壤中分离细菌在属水平上的组成基本一致，同时反映了该区域2010年~2015年间土壤中可培养细菌群落结构的稳定性。

图  2  北极新奥尔松地区可培养细菌的组成分析

Fig.  2  Composition of culturable bacteria isolated from Ny-Alesund

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16S rRNA基因序列相似性小于97%，被认为属于不同的种；相似性小于93%~95%，被认为属于不同的属。16S rRNA基因的测序与对比结果显示，编号为0303的菌株与模式菌株冷解糖芽孢杆菌(Bacillus psychrosaccharolyticus)ATCC23296相似性仅为78%，可能代表了1个潜在新种。对0303菌株进行系统发育分析发现，其与芽孢杆菌FJ555568的进化距离较近，在一个分支上。因此推测0303菌株可能是北极地区特有细菌。

图  3  0303菌株16S rRNA基因序列与参比序列构建的系统发育树图谱

(进化距离的计算采用Kimura双参数计算模型；树的拓扑形状采用邻接方法构建)

Fig.  3  Phylogenetic relationship of the 0303 isolate and other bacteria based on 16S rRNA gene homology.The tree was constructed using the neighbor-joining method with Kimura two-state parameter and pairwise-deletion model analyses

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2.3   可培养细菌的系统发育分析

为进一步了解细菌的分类地位，将16S rRNA基因测定序列与数据库中同源性最高的16S rRNA基因序列采用邻接方法构建系统发育树(图 4，5)。变形菌门系统发育树上嗜冷杆菌的9个种占据一大分支，置信度较高。近海生嗜冷杆菌(Psychrobacter maritimus)和Psychrobacter alimentarius聚于同一分支；Psychrobacter nivimaris和Psychrobacter aquimaris聚于同一分支；Psychrobacter cryohalolentis和Psychrobacter okhotskensis聚于同一分支；养料嗜冷杆菌(Psychrobacter cibarius)、Psychrobacter fozii、水栖嗜冷杆菌(Psychrobacter glacincola)聚于同一分支。嗜冷杆菌是1986年最初从动物身体上分离出来^[17]。研究发现，很多嗜冷杆菌分离自南极的鸟粪、海冰和磷虾，深海环境，太平洋的海水，印度洋中海鞘类的内部组织，鸽子粪便生物气溶胶等环境中。很明显，冷环境对嗜冷杆菌构成一个生态环境的缺口，而且南极环境也是嗜冷杆菌的主要来源^[18]。在北极样品中分离出大量嗜冷杆菌，也证明了极地是嗜冷杆菌的主要栖息地。希瓦氏菌属的两种菌分居在两个不同分支上，可能具有不同的特点。该菌属中绝大多数具有嗜冷或耐冷的特性，并且是典型的深海细菌类群之一^[19]。

图  4  北极奥尔松地区可培养细菌中变形菌门的系统发育树

Fig.  4  Neighbor-Joining tree showing the phylogenetic relationship of Proteobacteria sequences of culturable bacteria isolated from Ny-Alesund, Arctic

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图  5  北极奥尔松地区可培养细菌中其他类群的系统发育树

Fig.  5  Neighbor-Joining tree showing the phylogenetic relationship ofother phylum sequences of culturable bacteria isolated from Ny-Alesund, Arctic

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放线菌门细菌与拟杆菌门细菌相距较近，与厚壁菌门细菌相对较远。各菌株与对应模式菌株自展值几乎均为100%，置信度很高。厚壁菌门菌株是仅次于γ-变形菌纲的第二大优势类群，这些细菌壁较厚，抗逆性很好，适合极地独特的强辐射、酷寒、干燥的天然环境。厚壁菌门中芽孢杆菌是致病性细菌，它抵抗力很强，在干燥状态下可存活数十年，可引起人和动物多种疾病，非致病性芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌和多粘芽孢杆菌，而未确定的非致病性芽孢杆菌都归纳为疑似致病性芽孢杆菌^[20]。本研究发现的芽孢杆菌可能为致病菌，这表明北极可能存在致病性细菌。另外研究发现可能为Bacillus psychrosaccharolyticus的新种菌株，需要对其进行鉴定分析。本研究还分离出一些放线菌门的节杆菌，它们分布广泛，包括土壤、海洋、临床等环境，大部分是嗜温菌，绝对好氧^[21]。

北极特殊的环境蕴含着丰富的微生物种质资源，极地微生物往往具有适应其特殊环境的代谢特征及生理生化特征，对其开发利用将在医药、食品、化工及其他行业具有重要的应用价值。本研究通过对北极可培养细菌多样性分布特征进行分析，丰富了人们对极地微生物多样性空间异质性分布的认识，本研究结果也对该地区资源的进一步开发利用具有积极意义。

3   结论

(1) 北极黄河站科学考察采集的10个站位不同类型的沉积物和土壤样品进行可培养细菌多样性分析发现，47株可培养细菌归属于4个门，6个纲，18个属和29个种。其中，在属水平上，芽孢杆菌纲细菌的多样性最为丰富，共6个属。

(2) 北极新奥尔松地区可培养细菌在海洋沉积物、湖泊沉积物、河流沉积物及土壤中的种属构成存在差异，其中海洋沉积物中细菌多样性最为丰富，共11个属；而湖泊沉积物中细菌多样性次之，分属于6个属。

(3) 在菌株数量上，变形菌门占绝大多数，嗜冷杆菌是变形菌门的优势类群；厚壁菌门菌株是仅次于变形菌门的第二大优势类群。