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方斑东风螺“急性死亡症”病原及其毒力基因研究

刘晓靖 王瑞旋 凌慧 姚托 王江勇

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方斑东风螺“急性死亡症”病原及其毒力基因研究

    作者简介: 刘晓靖(1993-), 女, 山东烟台人, 硕士研究生, 从事贝类病害细菌致病性研究, E-mail:liuxiaojingtf@163.com;
    通讯作者: 王江勇, wjy104@163.com
  • 基金项目: 广东省渔港建设和渔业产业发展专项 海洋渔业科技推广方向-科技攻关与研发项目A201601B11
    三亚市农业科技创新项目 2015KJ05
    现代农业产业技术体系建设专项资金 CARS-48

  • 中图分类号: X171.5

Studies on the pathogenic bacteria and their virulence factors of "acute death syndrome" in Babylonia Areolata

    Corresponding author: Jiang-yong WANG, wjy104@163.com
  • CLC number: X171.5

  • 摘要: 为明确引起方斑东风螺(Babylonia areolata)"急性死亡症"的病原及相关的毒力因子,对"急性死亡症"疫区的方斑东风螺进行了病原分离纯化鉴定、人工感染试验等,经鉴定为塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)。本实验以4株分离自发病方斑东风螺且具有不同程度毒力的塔氏弧菌及东风螺组织样品为研究对象,根据半数致死剂量(LD50)确定菌株毒力大小依次为:BBXP1>FBC1>FB20>FB13,针对17种弧菌毒力相关基因进行了检测分析,结果显示强毒株BBXP1、FBC1中的毒力基因检出率最高,携带12种毒力基因,弱毒株FB13毒力基因检出率最低,携带7种,表明弧菌的致病性可能与其携带毒力基因的数量具有相关性。其中,不耐热溶血毒素基因tlh、胞外碱性丝氨酸蛋白酶基因asp、金属蛋白酶基因vtmp、几丁质外切酶基因chi36、锌金属蛋白酶基因vtpA、塔氏弧菌溶血素基因vthA在4株塔氏弧菌中检测均呈阳性,且仅在患有"急性死亡症"的东风螺组织样品中检测出,在健康的组织样品中未检测出。进一步通过实时荧光定量PCR方法检测此6种毒力基因在4株不同毒力的塔氏弧菌中的mRNA表达差异,结果显示,asp、vtpA的mRNA表达量与弧菌的毒力呈正相关,随着塔氏弧菌致病性的增强,vtpAasp的mRNA表达量呈上升趋势,且菌株的半致死剂量LD50与相对表达量具有显著相关性(r2=0.933,0.948;P < 0.05);溶血素vthA的表达量则与弧菌的致病性呈现负相关,相关性并不显著(r2=0.2401;P < 0.05),因此推测可能与其致病性关联不大;其它几种毒力基因的相对表达量与弧菌的毒力相关性不显著(P>0.05),可见同种毒力因子在不同毒力的菌株中相对表达量存在差异,推测塔氏弧菌致病株在侵染螺体的过程主要由金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶发挥主导作用。
  • 图 1  毒力基因在四株不同毒力的塔氏弧菌中mRNA表达量变化每个毒力基因各组差异显著(P < 0.05)

    Figure 1.  The mRNA expression of virulence genes in four strainsVibrio tubiashii with different virulence the difference of each virulence gene was significant (P < 0.05)

    图 2  4株塔氏弧菌中6个毒力基因mRNA表达量变化

    Figure 2.  Changes of mRNA expression ofsix virulence genes in four strains of Vibrio tubiashii

    表 1  不同毒力因子引物及弧菌鉴定引物

    Table 1.  Primers for different virulence factors and identification

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    表 2  方斑东风螺人工感染试验结果

    Table 2.  Results of artificial infection of B.areolata

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    表 3  毒力基因在不同毒力的致病菌和东风螺组织中的分布情况

    Table 3.  The presence of virulence genes in different pathogenic strains and visceral tissue of Babylonia

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出版历程
  • 收稿日期:  2017-07-17
  • 录用日期:  2017-09-16
  • 刊出日期:  2019-02-20

方斑东风螺“急性死亡症”病原及其毒力基因研究

    作者简介:刘晓靖(1993-), 女, 山东烟台人, 硕士研究生, 从事贝类病害细菌致病性研究, E-mail:liuxiaojingtf@163.com
    通讯作者: 王江勇, wjy104@163.com
  • 1. 中国水产科学研究院南海水产研究所, 广东省渔业环境重点实验室, 农业部南海渔业资源开发利用重点实验室, 广东 广州 510300
  • 2. 上海海洋大学 水产与生命学院, 上海 201306
基金项目:  广东省渔港建设和渔业产业发展专项 海洋渔业科技推广方向-科技攻关与研发项目A201601B11三亚市农业科技创新项目 2015KJ05现代农业产业技术体系建设专项资金 CARS-48

摘要: 为明确引起方斑东风螺(Babylonia areolata)"急性死亡症"的病原及相关的毒力因子,对"急性死亡症"疫区的方斑东风螺进行了病原分离纯化鉴定、人工感染试验等,经鉴定为塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)。本实验以4株分离自发病方斑东风螺且具有不同程度毒力的塔氏弧菌及东风螺组织样品为研究对象,根据半数致死剂量(LD50)确定菌株毒力大小依次为:BBXP1>FBC1>FB20>FB13,针对17种弧菌毒力相关基因进行了检测分析,结果显示强毒株BBXP1、FBC1中的毒力基因检出率最高,携带12种毒力基因,弱毒株FB13毒力基因检出率最低,携带7种,表明弧菌的致病性可能与其携带毒力基因的数量具有相关性。其中,不耐热溶血毒素基因tlh、胞外碱性丝氨酸蛋白酶基因asp、金属蛋白酶基因vtmp、几丁质外切酶基因chi36、锌金属蛋白酶基因vtpA、塔氏弧菌溶血素基因vthA在4株塔氏弧菌中检测均呈阳性,且仅在患有"急性死亡症"的东风螺组织样品中检测出,在健康的组织样品中未检测出。进一步通过实时荧光定量PCR方法检测此6种毒力基因在4株不同毒力的塔氏弧菌中的mRNA表达差异,结果显示,asp、vtpA的mRNA表达量与弧菌的毒力呈正相关,随着塔氏弧菌致病性的增强,vtpAasp的mRNA表达量呈上升趋势,且菌株的半致死剂量LD50与相对表达量具有显著相关性(r2=0.933,0.948;P < 0.05);溶血素vthA的表达量则与弧菌的致病性呈现负相关,相关性并不显著(r2=0.2401;P < 0.05),因此推测可能与其致病性关联不大;其它几种毒力基因的相对表达量与弧菌的毒力相关性不显著(P>0.05),可见同种毒力因子在不同毒力的菌株中相对表达量存在差异,推测塔氏弧菌致病株在侵染螺体的过程主要由金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶发挥主导作用。

English Abstract

  • 方斑东风螺(Babylonia areolata)简称东风螺,俗称花螺,隶属腹足纲、新腹足目(Neogastropoda)、蛾螺科(Buccinidae)、东风螺属(Babylonia)[1],主要分布在福建、广东、海南、广西的海岸。因其肉质鲜美,生长速度快,随着人工育苗以及养殖技术的发展,已经成为海水养殖的重要经济贝类。随着东风螺养殖规模的扩大,养殖环境逐渐恶化,各种暴发性病害频发,已严重威胁到东风螺养殖业的发展。目前已报道的引起东风螺发病的病原有聚缩虫、单孢子虫、纤毛虫等有害寄生性动物、细菌等[2-4],其中以弧菌为主的细菌性病害最为常见,给东风螺的产业化养殖带来了巨大的灾害。

    弧菌属于弧菌科弧菌属,是一类具极生鞭毛、能运动、无芽孢的短杆状革兰氏阴性菌,广泛分布于世界范围内的水生环境中,弧菌病是由弧菌属细菌引起的一种细菌性疾病,该病在全世界范围内广泛暴发,是水产养殖发展的重要限制性因素[5-6]。海洋弧菌被认为是影响贝类养殖过程中暴发严重性死亡事件的最严重的原因之一[7-9],塔氏弧菌(V.tubiashii)是孵化场中贝类死亡的主要致病因素之一,是海水养殖过程中不容忽视的致病菌[10]。最初在美国东海岸从患病的太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)中分离,近几十年来,塔氏弧菌不断地感染新宿主,比如熊本牡蛎(C.sikamea)和陆蛤(Panopea generosa)、菲律宾蛤仔(Venerupis philippinarum)、交叉蛤(V.decussate)和楔蛤(Donax trunculus) [11]等,近几年在法国感染了太平洋牡蛎和鲍鱼(Haliotis),发病均能导致较高死亡率[11]。2007年,太平洋中东地区双壳贝类幼体大量死亡,造成了整个地区主要孵化场高达59%的损失,经检测,均由塔氏弧菌感染引起的。2005年福建、广东、海南等地暴发的杂色鲍(H.diversicolor Reeve)幼苗大规模死亡事件中,王江勇[12]等研究分析,尽管这种大规模死亡可能由多种因素联合引起,但是从病鲍中分离出的塔氏弧菌经感染鉴定被确认为引起此次事件的主要细菌性病原;2014年,塔氏弧菌被确定为福建漳州刺参“腐皮综合征”的病原。明洪霞[7]等认为,近年来塔氏弧菌的再次暴发,虽然影响因素有很多,但是可以确定的是升高的海水温度是主要诱发因素之一。

    弧菌的致病性是弧菌与宿主及其组织、细胞间的一系列相互作用的综合结果,其致病过程包括粘附、侵染、体内增殖定植及分泌毒素等[8],涉及到这一系列过程的各种弧菌分子均可称为毒力因子,通常引起弧菌病暴发的原因主要有细菌侵袭介导的组织损伤[8]以及产生有毒胞外产物(ECPs)[9, 13]。已知海洋弧菌可产生多种胞外产物,这些致病性蛋白质包括溶细胞素、蛋白酶,脂酶,铁载体,多糖和通过Ⅲ型分泌系统递送的效应物等[14]。塔氏弧菌的致病性与其产生的多种毒力因子有关,研究发现,塔氏弧菌分泌的胞外蛋白酶、磷脂酶和溶血素[15-17]等可能是引起太平洋牡蛎幼体等双壳贝类的发病的主要毒力因子,但是否还有其它的毒力因子对其致病性起作用,有待研究。而luxRtoxRVcvphAchiAvhml等是弧菌的重要致病基因,且弧菌的致病机制非常复杂,存在许多毒力基因的转移机制,不同的弧菌种间可能存在相同的毒力基因,而相同的种内也可能存在不同的毒力基因[14]。前期研究发现了不同的塔氏弧菌菌株对东风螺的毒力存在较大差异,故很有必要深入了解其致病性与毒力基因的关系,这对于探讨塔氏弧菌的致病机制具有重要的意义。

    因此,本研究对以分离自海南省万宁某暴发“急性死亡症”的养殖场发病方斑东风螺的多个塔氏弧菌株为研究对象,旨在筛选引起发病的毒力因子,分析在不同毒力的病原菌中毒力因子的表达量的差异,以期为东风螺“急性死亡症”的病原弧菌的侵染机制及疾病预防提供参考依据。

    • 健康和患病的方斑东风螺样品于2016年4月分别取自海南省三亚市万宁某养殖场的“急性死亡症”发病初期的养殖池和未发病的养殖池,东风螺养殖群体壳长1.98±0.47 cm,单粒体质量5.48±0.85 g。攻毒试验感染用螺养殖于南海水产研究所深圳试验基地,螺苗来源于海南省三亚市万宁某养殖场,感染用螺壳长2.02±0.79 cm,单粒体质量5.29±0.78 g,暂养期间螺显示健康状态,暂养3 d后进行人工感染试验。

    • 营养琼脂培养基、脑心浸液琼脂培养基、硫代硫酸盐-柠檬酸钠-胆盐-蔗糖琼脂培养基(TCBS,广东环凯生物科技有限公司)、细菌基因组DNA提取试剂盒、小分子RNA提取试剂盒(Magen试剂公司)、反转录试剂盒(Takara公司)。

    • 每个患病的养殖池,剪取5只有“急性死亡症”症状的东风螺的内脏团,称取0.56 g进行组织匀浆,以高灭菌过的生理盐水稀释涂布于营养琼脂培养基、TCBS琼脂培养基,在28℃恒温箱中培养96 h后,分离纯化优势菌,进行人工感染和鉴定。

    • 菌株经分离纯化培养,挑取单菌落划线至营养琼脂斜面上,28℃生化培养箱培养20 h,加入灭菌生理盐水洗脱,采用活菌平板计数法计算菌液浓度,将菌液进行10倍稀释后,对东风螺进行肌肉注射,每个浓度梯度注射3组,每组注射10只,每只菌液剂量0.1 mL,另设对照组注射无菌生理盐水。注射感染之后每隔3 h记录死亡情况,连续记录10 d。感染期间不投喂饲料,全天充氧过滤,水温27±2℃,盐度28±2,pH 7.8±0.2。利用SPSS19.0软件计算菌株的半数致死剂量(The 50% lethal dose,LD50)[18]

      对感染后死亡的东风螺进行内脏团的细菌分离,结果分离得到菌落形态单一且与受试菌种一致的优势菌,对菌株进行分子鉴定、生理生化鉴定。

    • 使用Magen公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取病原菌的总DNA,以提取的总DNA为模板,进行PCR扩增,扩增引物为细菌通用引物8F/1492R,通用引物Hsp60[19],特异性弧菌鉴定引物RNA聚合酶α亚基rpoA引物[20],引物序列见表 1,25 uL体系中:12.5 uLPCR mix(Takara)、引物各1 uL,DNA模板1 uL,ddH2O 9.5 uL,扩增反应条件:8F/1492R;95℃预变性5 min,95℃变性40 s,48℃复性40 s,72℃延伸1.20 s,30个循环,72℃温育10 min;hsp60:94℃预变性2 min,94℃变性22 s,50℃复性40 s,72℃延伸40 min,30个循环,72℃温育7 min;rpoA:94℃预变性2 min,94℃变性22 s,50℃复性45 s,72℃延伸1 min,30个循环,72℃温育10 min。PCR产物经由Invitrogen公司测序,测序结果在NCBI Gene Bank数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行同源序列检索,确定该病原菌的种属。

      表 1  不同毒力因子引物及弧菌鉴定引物

      Table 1.  Primers for different virulence factors and identification

      同时进行生理生化特征检测,并检测主要的生理生化指标(革兰氏染色、鞭毛染色、氧化酶、触酶反应等),进行API(32E)系统鉴定。

    • 此次感染试验得到的病原菌BBXP1,以及3株于2015~2016年在海南省三亚市万宁某养殖场患病东风螺中分离的塔氏弧菌,经人工感染试验,测得具有不同的致病力(LD50),编号分别为FBC1、FB20、FB13,用Magen公司的细菌小量DNA提取试剂盒进行DNA提取,作为毒力基因检测的模板。

      对于东风螺组织的直接检测,取5只95%乙醇固定的健康和发病东风螺内脏团组织,分别剪碎混匀,用Magen公司的土壤DNA提取试剂盒进行提取总DNA,用于毒力基因的检测。

    • 选取了17种来自其他弧菌的重要致病基因。包括来自哈维弧菌的luxR[21]toxRVc[22]vphA[21]chiA[21]vhml[21]vhh[21];来自塔氏弧菌的vthA[23]vtpA[24];来自副溶血弧菌的tlh[23];来自霍乱弧菌及溶藻弧菌的毒力基因chi36[23]zot[24]、asp[23-24]toxS[24]tcpA[24];来自鳗弧菌的毒力基因flaC[24]flaB[24]。具体引物序列见表 1

      扩增条件为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,72℃延伸1 min,30个循环;72℃再延伸7 min。luxRchiAvhpA基因退火温度为50℃ 1 min; tox S基因退火温度为52℃1 min;zottlhflaCvhhtcpA基因退火温度为58℃ 1 min;vtpAvthA、chi36、toxRVcflaBvtmpaspvhml基因退火温度均60℃ 1 min。反应结束后,取6 μL于1%琼脂糖电泳检查结果。

    • 同1.2.4。

    • 采用Magen公司的小量细菌RNA提取试剂盒提取4株塔氏弧菌的RNA,按照试剂盒说明书提取,普通PCR验证DNA已经完全降解,逆转录反应按照Takara公司试剂盒说明书操作。

    • 通过1.2.4筛选7种毒力基因进行荧光定量PCR反应,检测其在不同致病力的塔氏弧菌中的表达情况。6种毒力基因分别为chi36、vtpAvthAtlhvtmpasp。引物序列见表 2

      表 2  方斑东风螺人工感染试验结果

      Table 2.  Results of artificial infection of B.areolata

      实时荧光定量PCR反应以SYBR Green作为荧光染料。反应体系为:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL(Takara公司),高压灭菌ddH2O 8.5 μL,正反向引物各各1 μL,cDNA模板各2 μL。扩增条件均为:95℃ 30 s,95℃ 5 s,60℃ 30 s,40个循环。反应结束后制备熔解曲线,其反应条件为:95℃ 15 s, 60℃ 30 s, 95℃ 15 s。每个反应设置3个复孔,阴性对照以ddH2O代替cDNA模板。以16s-rDNA为内参,采用2-ΔΔct[25]确定各个菌株不同毒力基因的mRNA相对表达量。

    • 使用SPSS19.0软件独立t检验检测6种毒力基因在不同致病性弧菌中的表达变化,采用方差分析法比较6种毒力因子在不同毒力的弧菌中的表达差异,对毒力基因的mRNA相对表达量和弧菌的半致死浓度进行相关性分析,并在相关性基础上进行回归分析,显著性差异设置为P < 0.05,试验数据以平均值±标准差表示,用GraphPad prism7.0分析做图,获得在不同毒力的菌株中毒力基因的表达差异。

    • 此次患“急性死亡症”的螺与健康的螺在形态上有很大的差异,其足部边缘呈皱缩状,足肌对外界的刺激不敏感,腹足呈黑色或者棕色。从患病方斑东风螺中分离得到优势菌BBXP1,经人工感染试验,用SPSS 19.0计算LD50。结果如表 2所示,在感染后死亡的螺进行细菌重分离的过程中,得到的也是与受试菌株相同的菌落形态单一的菌株。经16S rDNA通用引物、hsp 60、rpoA特异性引物鉴定,结果一致,菌株均为塔氏弧菌,相似度均为99%及以上,根据科赫氏法则证实该菌为此次导致东风螺急性死亡症的病原菌。通过LD50结合螺的发病症状,提示不同致病株毒力存在较大差异,最强毒株和最弱毒株的LD50差异约10000倍(表 2)。

      研究发现,不同环境条件下,即使同一地区分离的同一种类的致病菌毒力也会出现不同。弧菌生活在海洋水体这种特殊的环境中,温度的变化、CO2分压的升高均可能会加速弧菌的生长[26],因此当贝类暴露于较高温度、水质条件较差的环境时,致病性弧菌的毒力很可能骤增从而成为疾病暴发的元凶。

    • 本实验对4株具有不同致病性的塔氏弧菌以及不同健康状态的东风螺固定组织样品进行18种弧菌毒力基因检测,结果见表 3。由表 3可知,4株塔氏弧菌对于tlhaspvmpchi36、vtpAvthAzot 7种毒力基因的检出率为100%;toxRVcchiAtoxS 3种毒力基因仅在致病性较强的BBXP1中检出阳性;flaBtcpA在BBXP1、FBC1、FB20中均有检出阳性,而在致病性最弱的FB13中没有检出; luxRvphAvhmlvhhflaC 5种毒力基因在4株塔氏弧菌中均未呈阳性。同时,由表 3可知tlhaspvtmpchi36、vtpAvthA 6种毒力基因在患有“急性死亡症”的东风螺组织样品中均呈阳性,而在健康的组织样品中未检测到。zottoxS在健康和患病组织中均能检测到,而chiAluxRvphAvhmlvhhflaCtoxRvcflaBtcpA 9种毒力基因均未检测到。

      表 3  毒力基因在不同毒力的致病菌和东风螺组织中的分布情况

      Table 3.  The presence of virulence genes in different pathogenic strains and visceral tissue of Babylonia

      本实验针对18种弧菌毒力相关基因,对4株分离自方斑东风螺、具有不同致病性的塔氏弧菌,以及健康和发病东风螺的组织样品进行了检测,结果显示强毒株BBXP1毒力基因携带12种毒力基因,携带率最高,弱毒株FB13毒力基因携带7种,这表明弧菌的致病性可能与其携带毒力基因的数量有关;flaBtcpAtoxRvcchiAtoxS五种毒力基因仅在强毒株中被检出,推测可能与弧菌的致病力有一定的关系。方磊等[27]在对凡纳滨对虾病原的检测试验中,通过检测tlh基因在副溶血弧菌及病虾组织样中的分布,发现固定样品的核酸直接提取的检测方法和病样弧菌分离检测方法得到的毒力基因检出率的分布趋势基本相同,因此本实验直接检测了毒力基因分别在健康的东风螺组织样品以及患病的东风螺组织样品中的分布差别,发现tlhaspvtmpchi36、vtpAvthA 6种毒力基因仅在患有“急性死亡症”的东风螺组织样品中被检出,同时也在致病的弧菌中被检出。因此此种结果可以为固定样品法直接用于患病的东风螺的弧菌感染分析提供一定的数据支持。

      迄今对致病因子进行较深入研究所涉及的弧菌种类主要有霍乱弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌等。弧菌致病基因的复杂性及独特性是由弧菌间毒力基因的可变性决定的。有报道表明toxRVctlhtcpAfla C基因等是弧菌的重要致病基因[21-24],而对于海洋弧菌的毒力基因研究非常缺乏,海洋弧菌由于生活在水体环境种,更利于毒力因子或毒力基因的交换和传播,最终很可能造成致病株的扩散,从而威胁水生动物的健康。弧菌具有多种毒力因子,在弧菌侵入宿主机体引起发病的过程中发挥着重要的作用。据Nakamura等[28]报道,毒力基因具有高转移性,毒力基因的转移有益于各种环境和宿主生物体的存活。诚然,致病性塔氏弧菌也不例外,塔氏弧菌致病株甚至可能具有更高的获得外源DNA的能力。通过水平基因转移,并通过增加其对特定宿主的毒力或扩大其宿主范围来提高其感染水生生物的能力[21]。因此,充分掌握致病菌株的毒力因子及其相关的毒力基因,对水产养殖的可持续发展具有重要的意义。

    • 健康和发病组织DNA的毒力基因检测结果显示,tlhvtpAvthAaspchi36hevtmp 6种毒力基因仅在发病组织中呈阳性,而在健康组织中并未被检测到,同时在病原菌BBXP1中检测呈阳性,其它3株不同毒力的塔氏弧菌也被检测到,因此认为这6种毒力因子可能与方斑东风螺“急性死亡症”的发生有关。本实验以16S rDNA为内参基因,运用SYBR荧光定量PCR检测对方斑东风螺有不同致病性的的塔氏弧菌中这6种毒力因子的mRNA的表达量。检测结果如图 1图 2表示。从图 1中可以看出,4株毒性不同的塔氏弧菌中相同毒力因子的表达量差异显著(P < 0.05),随着金属蛋白酶(vtpA)、丝氨酸蛋白酶(asp)表达量的升高,菌株的毒力增强,而塔氏弧菌溶血素(vthA)的mRNA相对表达量的增多,菌株的毒力是呈现下降趋势,而溶血素(tlh)、金属蛋白酶(vtmp)、几丁质外切酶(chi36)的mRNA表达量与菌株毒力大小相关性并不显著。在图 2中可以看出,在同一株塔氏弧菌中不同的毒力因子表达量差异显著(P < 0.05)。

      图  1  毒力基因在四株不同毒力的塔氏弧菌中mRNA表达量变化每个毒力基因各组差异显著(P < 0.05)

      Figure 1.  The mRNA expression of virulence genes in four strainsVibrio tubiashii with different virulence the difference of each virulence gene was significant (P < 0.05)

      图  2  4株塔氏弧菌中6个毒力基因mRNA表达量变化

      Figure 2.  Changes of mRNA expression ofsix virulence genes in four strains of Vibrio tubiashii

      弧菌的致病性与其产生的多种毒力因子息息相关。毒力基因是产生各种毒力因子的物质基础,能通过毒力岛、温和噬菌体、质粒或插入序列等发生水平转移,同一种毒力因子可能会在多种弧菌中分布存在,而相同的弧菌种内也存在不同的毒力基因[14]。在塔氏弧菌中,已有毒力因子被验证对贝类有一定的致病性,包括低分子量ciliostatic毒素、溶血素和细胞外锌金属蛋白酶等[23]。至于是否有更多其它毒力因子,以及相关毒力基因与弧菌致病性的关联研究未见报道。

      Hasegawa[15]等研究发现塔氏弧菌能够引起太平洋牡蛎幼虫的死亡,此外,该菌株的完整或GP-HPLC分离的细胞外产物(ECPs)对幼虫表现出剧烈的毒性。不同胞外产物(ECPs)的LC-MS/MS分析显示存在细胞外金属蛋白酶和其他可疑的毒力因子,同时也发现了一些潜在毒力因子的表达。据报道,不同阶段的贝类发育对于弧菌的敏感性各不相同,幼虫期比成年个体更易感染弧菌[29],研究已证明塔氏弧菌及其胞外产物均可引起法国太平洋牡蛎幼贝发病。Hasegawa等人[15]研究证实,胞外蛋白酶和溶血素的产生在弧菌的致病过程中具有重要作用,并发现塔氏弧菌胞外金属蛋白酶和溶血素的表达与培养物的细胞密度相关,溶血素活性在早期生长期间增加,在静止期降低,而蛋白酶活性在细菌生长的所有阶段都增加,在稳定期达到最高水平的活性。本实验结果显示,溶血素和金属蛋白酶以及丝氨酸蛋白酶等毒力因子在不同毒力的菌株中表达量也是不同的,致病性最强的菌株蛋白酶表达量最多,且4株塔氏弧菌中,金属蛋白酶及丝氨酸蛋白酶的表达与其毒力相关较显著(r2=0.933,0.948;P < 0.05),而溶血素表达量相对较少,且溶血素的表达量与其毒力相关并不显著(r2=0.2401;P < 0.05),推测溶血素可能不是本次塔氏弧菌致病的最主要毒力因子,蛋白酶的表达可能与塔氏弧菌的毒力有极为密切的关系。Hasegawa和Hase[15]也使用塔氏弧菌突变菌株进行一系列蛋白酶抑制实验,检测了其金属蛋白酶和溶血素对太平洋牡蛎幼虫的致病性,发现金属蛋白酶是弧菌引起双壳类幼虫死亡最重要的因素之一,而溶血素对幼虫死亡率没有影响。此外,Labreuche Y等[13]还发现来自其它海洋弧菌的类金属蛋白酶对能够引起太平洋牡蛎幼贝的死亡。本研究发现金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶基因、溶血素基因均可以通过特异性引物在发病东风螺的组织样品中之间检出,而健康组织样中没有检出,且在进一步检测其与菌株毒性的相关性的研究中,发现随着这两种蛋白酶基因表达量的增多,菌株毒力也逐步增强,与菌株毒力呈显著正相关,充分证明了这2种胞外蛋白与塔氏弧菌的毒力有密切的关系。

      综上所述,笔者认为,具有不同致病力的塔氏弧菌,含有不同种类和数量的毒力基因,而同种毒力因子在不同毒力的菌株中相对表达量存在差异,这表明这种东风螺弧菌病的暴发存在复杂性,推测致病菌株在侵染螺体的过程主要由某一类毒力蛋白或基因,如金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶基因等发挥主导作用,进一步调动其它因子参与。可见,了解驱动毒力因子的产生及其致病的分子机制是预测和控制疾病暴发的基础。本研究将为贝类弧菌病的致病机制研究提供参考依据。

    • (1) 确诊此次引起海南省万宁市东风螺“急性死亡症”的病原为塔氏弧菌,结果显示LD50分别为2.93×105 cfu/g、3.34×107 cfu/g、9.25×106 cfu/g、1.61×109 cfu/g,表明同种弧菌的不同菌株毒力存在较大差异。

      (2) 针对17种弧菌致病相关的毒力基因的检测结果发现不同毒力的塔氏弧菌携带的毒力因子种类及数量存在差异,毒力基因数量与菌株毒力具有相关性(P < 0.05)。此外,tlhaspvtmpchi36、vtpAvthA 6种毒力基因仅在发病的组织中检测到,而健康的组织中并未检测出。

      (3) 同种毒力因子在不同毒力的菌株中相对表达量存在差异,溶血素和金属蛋白酶以及丝氨酸蛋白酶等毒力因子在不同毒力的菌株中表达量不同,致病性最强的菌株蛋白酶表达量最多,推测塔氏弧菌致病株在侵染螺体的过程主要由金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶发挥主导作用。

参考文献 (29)

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