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长江口及邻近海域沉积物中硝化与反硝化细菌分布特征研究

张欣泉 吴晓雅 甄毓 陈阳阳

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长江口及邻近海域沉积物中硝化与反硝化细菌分布特征研究

    作者简介: 张欣泉(1980-),男,山东济南人,博士研究生,主要研究方向为海洋环境生态学,E-mail:xqzhang@ouc.edu.cn;
    通讯作者: 陈阳阳,E-mail:chenyangyang_1988@163.com
  • 基金项目: 青岛海洋科学与技术国家实验室科技创新项目(2016ASKJ02);国家自然科学基金项目(41620104001)

Distribution characteristics of nitrifiers and denitrifiers in sediments from Changjiang Estuary and adjacent sea area

  • 摘要: 本研究应用DAPI荧光染色法和荧光定量PCR技术对长江口及邻近海域沉积物中的总细菌、好氧氨氧化细菌、反硝化细菌生物量的分布特征进行分析。结果表明,对于垂直分布,同一深度的反硝化细菌生物量明显高于好氧氨氧化细菌生物量,但二者的垂直分布趋势相似。沉积物的强烈混合有利于好氧氨氧化细菌和反硝化细菌的生存。柱状沉积物的深度是影响总细菌、好氧氨氧化细菌、反硝化细菌生物量垂直分布的最重要因素,且深度增加对好氧氨氧化细菌的影响大于对总细菌和反硝化细菌的影响。对于水平分布,总细菌生物量由近岸到远岸逐渐降低,亚硝酸盐浓度显著影响其水平分布。好氧氨氧化细菌和反硝化细菌生物量分别在长江口外和舟山群岛以南海域存在高值区,且溶解氧浓度和总氮含量是影响二者生物量水平分布的重要因素。本研究可为更加深入地认识细菌在河口及近岸海域氮循环过程中的作用提供依据。
  • 图 1  2010年4月和2011年7月航次沉积物采样站位

    Figure 1.  Sampling sites of sediments in April, 2010 and July, 2011

    图 2  2011年7月长江口及邻近海域表层沉积物和底层水中环境因子的分布

    Figure 2.  The horizontal distribution of the environmental factors in the surface sediments and bottom water from Changjiang Estuary and adjacent area in July, 2011

    图 3  33站柱状沉积物中环境因子的垂直分布

    Figure 3.  The vertical profile of the environmental factors in the gravity core from 33

    图 4  G6和33站柱状沉积物中总细菌、AOB、DB生物量的垂直分布

    Figure 4.  The vertical profile of the total bacterial, aerobic ammonium-oxidizing and denitrifying biomass in the gravity core from G6 and 33

    图 5  G6站和33站柱状沉积物中AOB和DB占细菌总量的比例变化

    Figure 5.  The vertical profile of proportion of aerobic ammonium-oxidizing and denitrifying biomass in the total bacteria in the gravity cores from G6 and 33, respectively

    图 6  2011年7月长江口及邻近海域表层沉积物中总细菌、AOB、DB生物量(ng C/g)的分布

    Figure 6.  The horizontal distribution of the total bacterial (A), aerobic ammonium-oxidizing (B) and denitrifying (C) biomass in the surface sediments from Changjiang Estuary and adjacent area in July, 2011

    表 1  33站柱状沉积物中总细菌、AOB、DB生物量与相关环境因子的相关性

    Table 1.  The correlation of the total bacterial, aerobic ammonium-oxidizing and denitrifying biomass with environmental factors in the gravity core from 33

    生物量沉积物深度磷酸盐浓度铵盐浓度亚硝酸盐浓度硝酸盐浓度
    总细菌生物量−0.733**0.565**−0.496*\\
    AOB生物量−0.883**0.613**−0.502*\\
    DB生物量−0.838**0.484*−0.581**\\
    注:*表示显著性P<0.05;**表示显著性P<0.01;\表示显著性P>0.05
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-04-22
  • 录用日期:  2019-12-17
  • 网络出版日期:  2020-01-08

长江口及邻近海域沉积物中硝化与反硝化细菌分布特征研究

    作者简介:张欣泉(1980-),男,山东济南人,博士研究生,主要研究方向为海洋环境生态学,E-mail:xqzhang@ouc.edu.cn
    通讯作者: 陈阳阳,E-mail:chenyangyang_1988@163.com
  • 1. 中国海洋大学 环境科学与工程学院,山东 青岛 266100
  • 2. 青岛海洋科学与技术国家实验室海洋生态与环境科学功能实验室,山东 青岛 266071
  • 3. 海洋环境与生态教育部重点实验室,山东 青岛 266100
  • 4. 山东农业大学 资源与环境学院,山东 泰安 271018
基金项目: 青岛海洋科学与技术国家实验室科技创新项目(2016ASKJ02);国家自然科学基金项目(41620104001)

摘要: 本研究应用DAPI荧光染色法和荧光定量PCR技术对长江口及邻近海域沉积物中的总细菌、好氧氨氧化细菌、反硝化细菌生物量的分布特征进行分析。结果表明,对于垂直分布,同一深度的反硝化细菌生物量明显高于好氧氨氧化细菌生物量,但二者的垂直分布趋势相似。沉积物的强烈混合有利于好氧氨氧化细菌和反硝化细菌的生存。柱状沉积物的深度是影响总细菌、好氧氨氧化细菌、反硝化细菌生物量垂直分布的最重要因素,且深度增加对好氧氨氧化细菌的影响大于对总细菌和反硝化细菌的影响。对于水平分布,总细菌生物量由近岸到远岸逐渐降低,亚硝酸盐浓度显著影响其水平分布。好氧氨氧化细菌和反硝化细菌生物量分别在长江口外和舟山群岛以南海域存在高值区,且溶解氧浓度和总氮含量是影响二者生物量水平分布的重要因素。本研究可为更加深入地认识细菌在河口及近岸海域氮循环过程中的作用提供依据。

English Abstract

  • 海洋沉积物是集化学物质和微生物于一体的特殊生态环境,是地球上最复杂的微生物栖息地。沉积物中丰富的微生物不但时刻进行着复杂的生理代谢活动,而且不断推动着碳、氮、硫、磷等生源要素的循环过程,对微生物的数量、种类和分布等生态特征进行研究,对于深入理解生物地球化学循环具有重要意义,也已成为生物海洋学的研究热点之一。

    沉积物中的氮循环对整个海洋氮循环举足轻重,是整个生物圈物质和能量循环的重要组成部分。其中由微生物推动的硝化作用和反硝化作用是氮循环的重要一环。由好氧氨氧化细菌(aerobic ammonium-oxidizing, AOB)推动、氨单加氧酶(ammonia monooxygenase, AMO)催化的将氨氧化为亚硝酸盐的亚硝化过程以及由反硝化细菌(denitrifying bacteria, DB)推动、亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase, Nir)催化的将亚硝酸盐还原为氧化氮的过程分别是硝化作用和反硝化作用的限速步骤[1],因此分别以编码AMO和Nir的amoAnir基因作为分子标记研究AOB和DB的群落特征及其与环境因子之间的关系对于理解氮循环规律具有重要意义[2]。需要注意的是,Nir包括功能相同而结构不同的两种酶:细胞色素cd1(NirS)和含铜(NirK)亚硝酸盐还原酶[1]。在海洋沉积物中,nirS基因丰度高于nirK基因[3],因此,相对而言nirS基因可更全面的研究海洋沉积物中的反硝化过程。

    过去的几十年中,在长江口及邻近海域开展的研究多围绕动力学、生态学和生源要素的生物地球化学循环等方面进行[4],而对环境微生物的研究则略显不足。近几年来,这方面的研究正逐步加强,如李佳霖等[5]对夏季长江口表层沉积物中硝化速率与硝化细菌数量的水平分布研究发现,在高盐度海区硝化细菌数量是影响硝化反应速率的主要因素,且硝化作用是影响长江口邻近海域夏初溶解态无机氮形态分布和底层溶解氧分布的主要因素之一;Zheng等[6]对长江口潮间带沉积物中nirS型反硝化菌的多样性、丰度和分布研究发现,nirS基因丰度与盐度显著相关。本文以长江口及邻近海域沉积物中的细菌为研究对象,应用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)荧光染色法对沉积物中细菌总量进行定量,同时利用荧光定量PCR技术测定AOB amoA基因和DB nirS基因的拷贝数,以期得到沉积物中总细菌、AOB、DB生物量的垂直和水平分布特征及其与环境因素的关系。本研究有助于了解微生物、氨氧化细菌和反硝化细菌在河口生态环境及氮循环中的作用机制以及丰度变化对河口环境的响应,可为估算该海域氮循环速率及微生物分子生态学研究提供基础资料。

    • 2010年4月乘“东方红2号”科学考察船在长江口及邻近海域的G6站采集柱状沉积物,2011年7月乘“润江号”科学考察船在长江口及邻近海域采集表层沉积物,同时在33站采集柱状沉积物(图1)。柱状沉积物样品按照20 cm以浅部分间隔1 cm、超过20 cm部分间隔2 cm的方式进行切割。所有沉积物样品置于无菌封口袋中于−80 ℃保存。

      图  1  2010年4月和2011年7月航次沉积物采样站位

      Figure 1.  Sampling sites of sediments in April, 2010 and July, 2011

    • 对于2011年7月表层沉积物样品的采集站位,底层水的温度、盐度和溶解氧浓度均由RBR XR-620多参数温盐深仪(Elcee, 马来西亚)现场测定。其它环境因子均在实验室进行测定,底层水的硝酸盐、亚硝酸盐和铵盐浓度由Quaatro营养盐自动分析仪(Seal Analytical Ltd., 英国)测定,表层沉积物中的总有机碳和总氮含量由FLASH 2000元素分析仪(Thermo Fisher Scientific Inc., 美国)测定。

      对于33站位的柱状沉积物样品,各深度沉积物间隙水中的硝酸盐、亚硝酸盐、铵盐、磷酸盐和硅酸盐浓度由Quaatro营养盐自动分析仪(Seal Analytical Ltd., 英国)测定,亚铁离子和锰离子浓度利用ICP-AES(Perkin Elmer INC.,美国)进行测定,硫酸盐浓度使用ICS-3000离子色谱(Diones, 美国)测定。

    • 称取约2 g沉积物样品,加入福尔马林溶液后于4 ℃暗处保存。根据陈琛等[8]的方法,将样品稀释10,000倍后加入少量曲拉通,用280 W超声仪(SK250H, 上海科导超声仪器有限公司)进行15 min超声浴。取1 mL处理后的样品加入1 mL 20 μg/mL DAPI染色剂于暗室染色30 min后过滤至0.2 μm聚碳酸酯膜(Whatman, 英国),然后,在荧光显微镜(BX51, OLYMPUS)紫外光下随机选择10个视野对蓝色、清晰可见的细胞进行计数(视野放大400倍)。

    • 根据Fukuda等[9]的研究,按照沉积物中细菌平均碳含量约为30.2 fg C/cell估算总细菌生物量,计算公式如下:

    • 称取约1.0 g沉积物样品,采用QiAampDNA Stool Mini Kit(Qiagen, 德国)试剂盒提取总DNA,操作根据试剂盒说明进行。将提取的DNA样品分别用引物amoA-1F(5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT)/amoA-2R(5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC)[10]以及cd3aF(5′-GTSAACGTSAAGGARACSGG)/R3cd(5′-GASTTCGGRTGSGTCTTGA)[11]进行PCR扩增,反应条件为:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,58 ℃(amoA基因)或53 ℃(nirS基因)退火45 s,72 ℃延伸45 s,35个循环;72 ℃延伸10 min。将PCR扩增得到的目的条带进行电泳检测、切胶回收后进行连接、转化和培养,然后通过蓝-白斑筛选分别得到转入amoAnirS基因的阳性克隆,并将其转入Luria-Bertani(LB)液体培养基中过夜培养。将培养后的菌液经电泳检测和测序验证阳性克隆后,用质粒提取纯化试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司,北京)制备质粒。质粒通过核酸蛋白仪(Picodrop, 英国)测得浓度,并按10倍梯度进行稀释后作为amoAnirS基因定量PCR的标准品,于−80 ℃保存。

    • 采用FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)试剂盒(Roche,德国),分别用amoA-1F/amoA-2R和cd3aF/ R3cd作为引物,以梯度稀释的amoAnirS基因质粒标准品为模板,在荧光定量PCR仪(ABI7500,Applied Biosystems,美国)上进行定量PCR反应。反应条件为:50 ℃孵育2 min;95 ℃预变性10 min;95 ℃变性15 s,58 ℃退火2 min,40个循环;nirS基因的反应程序为50 ℃孵育2 min;95 ℃预变性10 min;95 ℃变性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,40个循环。每组反应均需加入阴性对照,每个质粒浓度做3个平行样。以质粒拷贝数的对数值为横坐标,荧光定量PCR反应中相应的Ct值为纵坐标,分别绘制amoAnirS基因标准曲线。按照上述反应条件,以从样品中提取的总DNA为模板进行定量PCR分析,并通过标准曲线计算amoAnirS基因拷贝数。

    • 根据前人研究[12-13],按照每个细胞平均含2.5个amoA基因拷贝数和1个nirS基因拷贝数分别计算AOB和DB数量,并按照Fukuda等[9]的研究换算AOB和DB生物量,计算公式如下:

    • 使用SPSS 17.0软件的皮尔森(Pearson)相关系数法分析总细菌、AOB和DB生物量与环境因子间的相关性。

    • 2011年7月各站位表层沉积物样品相关环境因子的分布情况如图2所示。各站位底层水的温度、盐度和溶解氧浓度范围分别是17.9 ℃~27.2 ℃、15.7~34.5 mg/L和1.11~4.04 mg/L,沉积物的总有机碳和总氮含量范围分别为0.21%~0.85%和0.02%~0.11%,底层水中3种无机盐浓度由高到低依次为硝酸盐、亚硝酸盐和铵盐,其浓度范围分别是0.00~187.01 μmol/L、0.00~1.48 μmol/L和0.92~6.20 μmol/L。

      图  2  2011年7月长江口及邻近海域表层沉积物和底层水中环境因子的分布

      Figure 2.  The horizontal distribution of the environmental factors in the surface sediments and bottom water from Changjiang Estuary and adjacent area in July, 2011

      2011年7月采集的33站柱状沉积物样品中各环境因子随沉积物深度的变化情况如图3所示。在该柱状沉积物中,磷酸盐、硅酸盐、亚铁离子和锰离子的浓度范围分别是8.56~13.06 μmol/L、210.16~337.35 μmol/L、5.57~61.70 μmol/L和20.36~59.92 μmol/L,其整体趋势均为随深度的增加而降低;铵盐和硫酸盐的浓度范围分别是12.72~151.65 μmol/L和24.11~26.18 mmol/L,其整体趋势均为随深度的增加而升高;亚硝酸盐和硝酸盐的浓度范围分别是0.02~0.47 μmol/L和1.13~5.84 μmol/L。

      图  3  33站柱状沉积物中环境因子的垂直分布

      Figure 3.  The vertical profile of the environmental factors in the gravity core from 33

    • G6站和33站分别获得23 cm和50 cm柱状样,根据细菌计数和荧光定量PCR检测结果、拷贝数和细胞数之间以及细胞数和生物量之间的换算关系,可得到G6站和33站柱状沉积物中总细菌、AOB、DB生物量随深度的变化情况(图4)。

      图  4  G6和33站柱状沉积物中总细菌、AOB、DB生物量的垂直分布

      Figure 4.  The vertical profile of the total bacterial, aerobic ammonium-oxidizing and denitrifying biomass in the gravity core from G6 and 33

      整体来说,G6和33站柱状沉积物中的总细菌、AOB、DB均在表层最为丰富,且随沉积物深度的增加而减少,这表明表层沉积物接近上覆水,包括营养元素、溶解氧、温度等在内的环境条件利于总细菌、AOB和DB的生存;而随着深度的增加,总细菌、AOB、DB生长的限制因子增多,生物量随之减少[14]。该生物量垂直分布趋势及分析与Lin等[14]和Sokoll等[15]分别在台湾西南部海底沉积物和阿拉伯海沉积物中对AOB和DB的研究结果类似。并且,33站位柱状沉积物中磷酸盐、铵盐等环境因素的垂直分布趋势支持此结果(图3)。具体来看,在G6站的20 cm以浅部分和33站的5 cm以浅部分,总细菌、AOB、DB的生物量均波动较大;之后,两站位总体均呈降低趋势。此垂直分布特征主要受不同的地理位置、动力条件影响:沉积物的再悬浮作用使浅层沉积物发生混合,形成波动层,由总细菌、AOB、DB生物量及过剩210Pb随深度的变化规律[16]可反映出G6站、33站的波动层分别为20 cm、5 cm。并且,G6站比33站的波动层深且波动幅度大,可能是因为G6站位于长江口外淡咸水的强烈混合区[17]以及长江口泥质区,而33站位于浙闽沿岸泥质区的外围,G6站比33站再悬浮强烈而致使沉积物混合更为频繁强烈。另外,AOB比总细菌、DB的降低趋势更明显,即深度增加对AOB的影响大于对总细菌、DB的影响。

      传统上认为,AOB和DB分别适宜在有氧和低氧/缺氧条件下生存,且柱状沉积物中的溶解氧浓度随深度增加而降低[18],由此可推断AOB和DB生物量在柱状沉积物中的垂直分布趋势存在较大差异。然而,在本研究中,AOB和DB生物量的垂直分布趋势高度相似(r≥0.80,P<0.01),这与Huang等[19]在夏季对珠江沉积物中AOB和DB丰度的检测结果一致。AOB生物量在溶解氧浓度较高的沉积物上层较高,产生较多的亚硝酸盐和硝酸盐,可为DB介导的反硝化作用提供较多底物,故而DB生物量在沉积物上层较高;随着深度的增加,溶解氧逐渐较少,抑制了氨氧化作用,从而产生较少的硝酸盐和亚硝酸盐,并积累了铵盐,进而抑制了反硝化作用,因此,AOB和DB生物量均随深度的增加而减少[14, 19]。此结论与柱状沉积物中硝酸盐、亚硝酸盐和铵盐浓度的垂直分布趋势一致(表1图3)。

      生物量沉积物深度磷酸盐浓度铵盐浓度亚硝酸盐浓度硝酸盐浓度
      总细菌生物量−0.733**0.565**−0.496*\\
      AOB生物量−0.883**0.613**−0.502*\\
      DB生物量−0.838**0.484*−0.581**\\
      注:*表示显著性P<0.05;**表示显著性P<0.01;\表示显著性P>0.05

      表 1  33站柱状沉积物中总细菌、AOB、DB生物量与相关环境因子的相关性

      Table 1.  The correlation of the total bacterial, aerobic ammonium-oxidizing and denitrifying biomass with environmental factors in the gravity core from 33

      根据33站柱状沉积物样品中总细菌、AOB、DB生物量和环境因子数据可得到生物量与环境因子间的相关关系(表1)。分析结果表明,柱状沉积物的深度是影响总细菌、AOB、DB生物量垂直分布的最重要因素,且它们的相关系数比较可进一步证明深度增加对AOB的影响大于对总细菌、DB的影响。

      33站中AOB和DB占微生物总量的比例比较稳定,而G6站中AOB和DB占总细菌生物量的比例则在不同深度有很大范围的波动(图5),说明剧烈混合为AOB和DB的生存提供了有利条件,可以在沉积物的较深层次推动氨氧化和反硝化作用,也就为河口区的硝化和反硝化作用提供了更加有力的支持。

      图  5  G6站和33站柱状沉积物中AOB和DB占细菌总量的比例变化

      Figure 5.  The vertical profile of proportion of aerobic ammonium-oxidizing and denitrifying biomass in the total bacteria in the gravity cores from G6 and 33, respectively

    • 根据细菌计数和荧光定量PCR检测结果、拷贝数和细胞数之间以及细胞数和生物量之间的换算关系,可得到总细菌、AOB、DB生物量在长江口及邻近海域表层沉积物中的分布图(图6)。

      图  6  2011年7月长江口及邻近海域表层沉积物中总细菌、AOB、DB生物量(ng C/g)的分布

      Figure 6.  The horizontal distribution of the total bacterial (A), aerobic ammonium-oxidizing (B) and denitrifying (C) biomass in the surface sediments from Changjiang Estuary and adjacent area in July, 2011

      在表层沉积物中,总细菌生物量在105数量级,由近岸到远岸逐渐降低,且长江口和浙江近岸海域存在明显的高值区。这可能是由于进入海洋的陆源物质受到长江冲淡水、钱塘江冲淡水的影响以及淡咸水强烈混合的作用,絮凝沉降到海底[17],致使近岸尤其是靠近长江口和浙江近岸海域的沉积物能够得到较多的营养物质,利于细菌生存,生物量丰富。表层沉积物中总细菌生物量与亚硝酸盐浓度的显著正相关关系(r=0.511,P<0.05)支持此结论。

      DB生物量明显高于AOB生物量,二者数量级分别为101~103和103~104。而且,AOB和DB生物量在长江口和舟山群岛海域均存在高值区。这与Liu等[20]对东海陆架区表层沉积物的分布类型研究有高度的重合性,即AOB和DB生物量的高值区均位于粘土区,表明AOB和DB主要分布于粘土区。由李佳霖等[5, 21]对长江口邻近海域夏季沉积物的硝化和反硝化速率及细菌数量的分布特征的研究可知,硝化和反硝化速率及细菌数量均在长江口存在高值区,与本研究中的AOB和DB高值区位置基本重合,即AOB和DB生物量高的区域,硝化和反硝化速率也高。另外,AOB和DB生物的极大值区与总有机碳含量高值区位置大体一致,但相关性不显著(P>0.05);与溶解氧浓度低值区、总氮含量高值区基本重合,且分别与溶解氧浓度(r=−0.486,P<0.05;r=−0.487,P<0.05)呈负相关,与总氮含量(r=0.455,P<0.05;r=0.602,P<0.01)呈正相关(图2)。由此可知,溶解氧浓度和总氮含量是影响AOB和DB生物量水平分布的重要因素,并且AOB和DB生物量高值区的分布可能与夏季长江口邻近海域低氧区的形成有密切关系。

    • (1)柱状沉积物的深度是影响总细菌、AOB、DB生物量垂直分布的主要因素。由再悬浮作用及地理位置不同导致的沉积物环境条件差异,造成了G6站比33站的沉积物混合更为强烈,进而为AOB和DB的生存提供了有利条件。

      (2)总细菌生物量由近岸到远岸逐渐降低,并且受到亚硝酸盐浓度的显著影响。溶解氧浓度和总氮含量是影响AOB和DB生物量水平分布的重要因素。二者在长江口外和舟山群岛外海域均存在高值区,其分布可能与夏季长江口邻近海域低氧区的形成有密切关系。

      致谢:感谢“东方红2号”和“润江号”科学考察船全体人员在样品采集中提供的帮助。感谢屈欣豪同学在细菌DAPI染色计数中付出的努力。

参考文献 (21)

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