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海水中溶解氨基酸分析技术的研究进展

袁蕾 张纯超 吕彦儒

引用本文:
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海水中溶解氨基酸分析技术的研究进展

    作者简介: 袁 蕾(1984-),女,山东青岛人,硕士研究生,工程师,主要从事海洋监测工作,E-mail:yuanleixy@126.com;
  • 基金项目: 国家海洋局南海分局海洋科学技术局长基金项目(1238);本论文得到中国国家留学基金资助
  • 中图分类号: X142

Advances in analytical technique research for dissolved amino acids in seawater

  • 摘要: 随着对海洋中有机氮生物地球化学循环过程认识的逐步深入,氨基酸作为海洋有机氮库中最易被生物利用的组分之一愈加受到重视。关于海洋中氨基酸含量组成和生物可利用性的相关研究对认识海洋中有机氮的迁移和转化具有重要意义。本文详细的讲解了海洋领域分光法和荧光法等溶解氨基酸测定方法及离子色谱和液相色谱等色谱分离方法的发展历程,对应用最普遍的柱前衍生-反相液相色谱-荧光检测法等技术进行了更为详细的评述,之后列举了质谱技术、单体同位素分析技术和毛细管电泳等最新发展的技术方法,并对它们在海洋学中的应用提出了展望。
  • 图 1  海水中OPA与氨基酸的反应[50]

    Figure 1.  Reaction of OPA with primary amino acids in seawater

    表 1  部分研究采用的实验条件

    Table 1.  Experiment conditions in some researches

    衍生化试剂 洗脱液 梯度洗脱程序(以B算) 激发/吸收波长 文献来源
    OPA
    2-巯基乙醇
    A:0.1M磷酸盐缓冲液 (pH7.5)
    B:甲醇
    20min内由35%到80% 330nm/
    418nm
    [28]
    OPA
    2-巯基乙醇
    A:0.05M醋酸钠(pH5.8)/2%四氢呋喃
    B:甲醇
    0~6 min,25%到50%;6~8 min, 50%;8~10 min, 50%到60%;10~12 min,60%;12~13 min, 60%到80%;13~15 min,80%;15~16 min,80%到25% 340nm/
    410nm
    [71]
    OPA
    2-巯基乙醇
    A:0.05M醋酸钠/5%四氢呋喃
    B:甲醇
    35 min内从20%到65%,4min内从65%到100%并保持2min 330nm/
    418nm
    [72]
    OPA
    3-巯基丙酸
    A:0.05M醋酸钠, pH7.2
    B: 0.1M醋酸钠/乙腈/甲醇(v:v:v=45:45:10, pH7.2)
    0~6 min,10%到15%;6~16 min, 15%到37%;16~30 min,37%到55%;之后降到10%并保持3min 337nm/
    454nm
    [73]
    OPA
    2-巯基乙醇
    A:0.05M醋酸钠/5%四氢呋喃
    B:甲醇
    0~12 min,5%到20%;12~35 min,20%到65%;35~39 min,65%到100%;39~41 min,100% 342nm/
    452nm
    [17]
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-07-09
  • 录用日期:  2019-09-30
  • 网络出版日期:  2020-01-06

海水中溶解氨基酸分析技术的研究进展

    作者简介:袁 蕾(1984-),女,山东青岛人,硕士研究生,工程师,主要从事海洋监测工作,E-mail:yuanleixy@126.com
  • 国家海洋局南海环境监测中心,广东 广州 510300
基金项目: 国家海洋局南海分局海洋科学技术局长基金项目(1238);本论文得到中国国家留学基金资助

摘要: 随着对海洋中有机氮生物地球化学循环过程认识的逐步深入,氨基酸作为海洋有机氮库中最易被生物利用的组分之一愈加受到重视。关于海洋中氨基酸含量组成和生物可利用性的相关研究对认识海洋中有机氮的迁移和转化具有重要意义。本文详细的讲解了海洋领域分光法和荧光法等溶解氨基酸测定方法及离子色谱和液相色谱等色谱分离方法的发展历程,对应用最普遍的柱前衍生-反相液相色谱-荧光检测法等技术进行了更为详细的评述,之后列举了质谱技术、单体同位素分析技术和毛细管电泳等最新发展的技术方法,并对它们在海洋学中的应用提出了展望。

English Abstract

  • 早期研究认为浮游植物主要利用溶解无机氮(DIN, dissolved inorganic nitrogen, 硝酸盐氮、亚硝酸盐氮和氨氮之和),而有机氮几乎不能被直接利用[1-2],因此大多数研究主要围绕无机氮的分析及生物利用展开。但也有少数研究者开展了溶解有机氮(DON, dissolved organic nitrogen)生物利用方面的研究。Putter在1909年最先提出海洋生物可以直接利用含氮有机物质的假设[3],到Antia等提出DON在水体初级生产力中的重要性[4],DON的吸收利用逐渐受到学术界的重视。随着对浮游植物营养生理学认识的深入,越来越多的研究者开始认同自养生物与异养细菌都可以直接利用DON,特别是小分子量的DON[2, 5-7]。此外,由于有机氮在总氮中所占的比重[2, 8]较大,且它对近海频发的赤潮等环境问题产生了重要影响[9-10],这使得相关研究的重要性愈加明显。

    溶解氨基酸是DON中最易被生物利用的组分之一,是海洋DON库中已识别组分的最大组成部分(约占15%[11]),同时也是溶解有机碳(DOC, dissolved organic carbon)中已识别生物组分中的第二大部分(约占7.7%[12])。氨基酸是大部分海洋生物体内有机碳和有机氮的主要存在形式[13-14],与海洋生物活动密切相关,浮游植物和细菌均可以对其进行摄取和释放[11, 15]。因此,氨基酸在有机碳和有机氮的生物地球化学循环中地位至关重要。

    总溶解氨基酸(THAA, total hydrolysable amino acid) 是表征海洋中溶解氨基酸的常用指标,其根据存在状态又可以分为溶解游离氨基酸(DFAA, dissolved free amino acid)和溶解结合氨基酸(DCAA, dissolved combined amino acid)。DFAA在海洋中含量极低,只占DON的1.2%~12.5%[16],虽然在某些贫营养海区中可能远超这一比例[17]。DFAA具有极短的周转时间,尤其在无机氮含量很低的环境中,可以被微藻直接吸收利用[18-20]。此外,有研究指出珊瑚礁群落也可以对DFAA进行同化吸收[21]。DCAA的含量是DFAA的十数倍,占THAA的绝大部分。研究表明在DFAA含量或周转效率极低的情况下,DCAA可以被细菌优先吸收利用,同时在碳、氮循环中亦起重要作用[19]。DFAA的含量可以通过衍生化后直接测定获得,THAA样品水解为DFAA后测定,而DCAA通过THAA与DFAA的差值获得。因此之后的讨论基本围绕DFAA分析方法展开,THAA的水解技术因为已经获得广泛的认同和发展,在此处仅略有涉及。

    虽然对海水中氨基酸的关注一直存在,但是由于其含量极低,在分析过程中极易引入误差,直到20世纪50年代末才有相关的研究发表[22],这之后的大量研究尝试采用多种分析方法来解决这一难题 [23-26]。最具有里程碑意义的发展出现在1979年,Garrasi et al.[27]首先提出了基于离子色谱-氨基酸分析仪的高灵敏度方法,以及之后不久Lindroth和Mopper[28]提出的OPA衍生化-反相液相色谱直接进样分析方法,进行海水中DFAA含量的测定,优化掉了繁琐费时和容易引入误差的富集和脱盐过程[24, 27, 29],尤其后者因为其更高的灵敏度和简便的操作在之后的研究中得到广泛应用。本文归纳总结了海水中溶解氨基酸主要分析技术的发展,探讨了各分析方法的不同特点,以此为今后海水中氨基酸的研究提供借鉴和技术支持。

    • 大多数的氨基酸不具有紫外吸收或荧光响应,因此需要先进行衍生化反应后才能进入检测器进行测定。根据原理的不同,DFAA的测定方法可以分为分光法、荧光法、质谱法和电泳法等,前两种方法在海洋领域应用较为广泛,而在进入检测器之前与色谱等分离方法联用可以获得单个氨基酸的含量。

      占THAA绝大部分的DCAA不能被直接测定,需要先水解为DFAA,常用的水解条件为加入过量6 M HCl或等量12 M HCl后于110 ℃加热20~24 h[15, 24, 30-33]。加热必须保证在惰性条件(氮气或氩气填充)下进行,且如果硝酸盐浓度超过6±2 µmol/L,需要添加抗坏血酸以防止氨基酸氧化降解[31, 33-34]。需要特别注意的是水解过程会引发氨基酸手性异构体的转化(外消旋作用)[35],因此需要对转化的比例进行评估并决定是否对结果进行修正[36]。此外,气相水解法在海洋领域氨基酸的测定中也有一定的应用[37-38]

    • 原理是基于氨基酸与茚三酮反应生成有色物质,通过分光光度计测定有色物质含量进而得到对应的氨基酸的含量[39]。脯氨酸的测定波长为440 nm,不同于其它氨基酸的570 nm,因此需要单独测定。这种方法缺点是灵敏度较低,因此需要对大量的海水样品进行浓缩和脱盐[25, 40]。此外,肽、蛋白质和其它含有自由氨基的组分也可以与茚三酮反应生成有色物质,且通过计算得到的各氨基酸浓度存在不同程度的错估[41]等,都使得这种方法的准确性和推广受到限制。但是,在荧光法出现之前,这种方法提供了一种获得海水中氨基酸含量的有效途径,尤其基于离子交换色谱-柱后茚三酮衍生化的氨基酸分析仪[41]的发明极大的促进了此方法的广泛应用[26, 29]

      此外,也有利用氨基酸与其它反应试剂反应生成有色产物进行的研究[42],但是仍然存在样品需求量大和误差大等缺陷,并且难以进行定量分析。

    • 原理是基于氨基酸与荧光试剂反应生成荧光活性物质,通过荧光检测器测定荧光强度进而得到对应的氨基酸的含量。这种方法的出现将灵敏度提升了2~3个数量级[22],荧光试剂荧光胺尤其是邻苯二甲醛(OPA, o-phthaldialdehyde)的出现和使用大幅提高了海水中氨基酸分析方法的灵敏度[43-44],大大缩减了样品的需求量,进而促进了不需要脱盐和浓缩而直接进样的高灵敏度方法[27-28]的发展,进而减少了误差的产生。鉴于荧光胺和OPA均是与氨基(-NH2)而不是氨基酸的(-(NH2)COOH)反应,实际测得的是总溶解游离伯胺(TDFPA, total dissolved free primary amines)[40, 45],使用OPA的结果更是被定义为ORS(OPA reactive substances)[46]

      荧光胺由Weigele等[43]设计合成,它的出现极大提高了氨基酸检测的灵敏度并获得了一定应用[47-48],但是它在水溶液中不稳定,会水解为非荧光活性的物质[47]。现今最广泛使用的衍生化试剂OPA由Roth[49]最先提出使用,它在强还原剂(如硼氢化钾或 2-巯基乙醇)环境下与氨基酸发生衍生化反应获得荧光强度(图1[50]。OPA可以稳定的存在于缓冲溶液中,并且比荧光胺更为灵敏[30, 51]。Parsons[30]发表了一种OPA衍生化-荧光检测器测定海水中氨基酸的简便手动方法,适用于常规监测,也可以结合流动注射[52]或分段流动分析[53]等手段实现分析过程的自动化或者结合时间分辨荧光光谱实现海水中氨基酸的在线监测[54]。目前为止,OPA衍生化最常与高效液相色谱(HPLC, high-performance liquid chromatography)联用,以实现各氨基酸的分离和测定,虽然仍存在OPA不能与二级氨基酸反应[49]、半胱氨酸和胱氨酸衍生物荧光强度弱[51]等缺点。

      图  1  海水中OPA与氨基酸的反应[50]

      Figure 1.  Reaction of OPA with primary amino acids in seawater

      除荧光胺和OPA外,也有研究尝试利用其它物质作为衍生化试剂[55-56],最终因为荧光强度的不足而没有被继续采用。

    • 海水中溶解氨基酸的分离方法主要有纸色谱和薄层色谱法(paper and thin-layer chromatography)、离子交换色谱法(IEC, ion exchange chromatography)、气相色谱法(GC, gas chromatography)和HPLC等。

      最早期测定海水中氨基酸的研究中,海水样品酸化后蒸干并用乙醇溶解去除盐分[57]或者与Fe(OH)3共沉淀去除盐分[23];样品经离子交换树脂进一步纯化后转移到纸色谱或薄层色谱上,不同氨基酸因为分配系数不同而随溶剂移动不同的距离。因为氨基酸没有颜色,之后需要与茚三酮反应生成“罗曼紫”斑点才能进行识别。直接用扫描仪扫描[58]或者将斑点溶解于合适试剂中,用分光光度计测定吸光强度[25]。因为这种方法检测灵敏度较低,需要浓缩大量的海水样品,海水中的盐分及有机物质同时产生富集而容易产生干扰,因此需要在最终的测定之前对水质样品进行脱盐和净化处理,而这往往与样品的富集过程同时进行[25, 58-60]。冗长的前处理过程和结果的难以量化,均使得这种方法很快被替代。

    • 最常用的为阳离子交换色谱-柱后衍生法。原理是样品中的氨基酸在pH约为2时可以被阳离子交换树脂吸附,提高流动相pH,氨基酸正电荷减少,吸附力减弱,最后被完全洗脱下来。由于极性和分子大小等的差异,不同氨基酸在阳离子交换树脂上吸附能力存在差别,从而被分离。早期的研究将分离后的氨基酸与茚三酮在加热条件下进行显色反应,使用分光检测器在570 nm和440 nm(脯氨酸)分别测定吸光值[23, 61-62],这同时也是最初的氨基酸自动分析仪的工作原理[41]。Dawson等[24]将氨基酸自动分析仪改装为使用荧光试剂(OPA、2-巯基乙醇和硼酸钠缓冲溶液,pH=9)和荧光检测器(激发/发射波长Ex/Em=340 nm/455 nm),大大提高了方法的灵敏度,费用低且大幅缩短了分析所需要的时间及样品量,但是仍需要通过离子交换树脂对样品进行富集,且不能直接测定二级氨基酸;Garrasi等[27]建立了一种OPA柱后衍生化、基于离子交换-氨基酸分析仪的、可用于海水DFAA直接进样分析的方法,灵敏度高且避免了脱盐和富集过程的误差,然而昂贵的仪器购买和维护费用、较长的分析时间(4 h)、大部分的商用氨基酸分析仪不适用于现场分析以及Lindroth等[28]在同年发表的更为灵敏简便的方法等均限制了这种方法的推广和使用[50, 61]

      此外,Clarke[63]等人提出的阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法可以无需衍生化直接分离多种介质中的氨基酸[64-65],但是并没有应用于海洋样品中的研究报道。

    • GC的高灵敏性促使科学家使用这种方法测定低含量的氨基酸,但是由于氨基酸含有羧基、氨基、羟基和硫基等基团,不易挥发,必须先反应生成挥发性强的衍生化产物(如三氟乙酰烷基酯)才可以采用GC进行分离测定[66]。Pocklington[67]将北大西洋海水中的DFAA通过三甲基硅烷化反应生成挥发性产物,通过配备两根不同色谱柱的GC系统进行快速定量分析,可以检出10−11 mol/L的蛋白质氨基酸及一些非蛋白质氨基酸。此外,GC也被用来测定氨基酸的D/L异构体[29]。但是繁琐的脱盐和衍生化过程限制了该方法在海洋科学领域的应用,现在较多被用于生命液体中氨基酸的测定,或与质谱技术联合使用[68-69]

    • 应用最广泛的方法为OPA柱前衍生-反相HPLC法(OPA-HPLC)。这种方法最先由Lindroth等[28]提出用于海水中DFAA的测定,检出限达到fmol级,并且在船载实时测定实验中也获得了很好的结果[70]。虽然OPA-HPLC分析方法并不完美[49, 51],但是仍因为其快速简单和仪器简便易得的优势在研究中获得广泛应用,促使了海洋领域之前很多无法进行的研究的开展。研究中这种方法的缺陷也进行了不断的改进,比如在流动相中添加四氢呋喃[17, 71-72]或用3-巯基丙酸[73]或乙硫醇[74]替代2-巯基乙醇改善甘氨酸和苏氨酸的分离;将半胱氨酸和胱氨酸先通过反应生成磺基丙氨酸或S-3-磺丙基半胱氨酸,之后可以通过OPA-HPLC方法检出[17, 75];改变OPA溶液的浓度及用量以获得更好的衍生化效果[17, 70];提高色谱柱柱温、调整洗脱液浓度和洗脱程序以获得更好的分离效果[17, 73];或者通过微调荧光检测器的发射波长和接收波长获得更强的荧光信号[17, 71]等。此外,也有研究采用OPA/乙硫醇和9-芴甲基氯甲酸酯的两步衍生法以同时测定DFAA和短链脂肪族聚胺[74]表1为部分研究采用的实验条件。

      衍生化试剂 洗脱液 梯度洗脱程序(以B算) 激发/吸收波长 文献来源
      OPA
      2-巯基乙醇
      A:0.1M磷酸盐缓冲液 (pH7.5)
      B:甲醇
      20min内由35%到80% 330nm/
      418nm
      [28]
      OPA
      2-巯基乙醇
      A:0.05M醋酸钠(pH5.8)/2%四氢呋喃
      B:甲醇
      0~6 min,25%到50%;6~8 min, 50%;8~10 min, 50%到60%;10~12 min,60%;12~13 min, 60%到80%;13~15 min,80%;15~16 min,80%到25% 340nm/
      410nm
      [71]
      OPA
      2-巯基乙醇
      A:0.05M醋酸钠/5%四氢呋喃
      B:甲醇
      35 min内从20%到65%,4min内从65%到100%并保持2min 330nm/
      418nm
      [72]
      OPA
      3-巯基丙酸
      A:0.05M醋酸钠, pH7.2
      B: 0.1M醋酸钠/乙腈/甲醇(v:v:v=45:45:10, pH7.2)
      0~6 min,10%到15%;6~16 min, 15%到37%;16~30 min,37%到55%;之后降到10%并保持3min 337nm/
      454nm
      [73]
      OPA
      2-巯基乙醇
      A:0.05M醋酸钠/5%四氢呋喃
      B:甲醇
      0~12 min,5%到20%;12~35 min,20%到65%;35~39 min,65%到100%;39~41 min,100% 342nm/
      452nm
      [17]

      表 1  部分研究采用的实验条件

      Table 1.  Experiment conditions in some researches

      氨基酸手性异构体(L-氨基酸和D-氨基酸)的分离和测定是HPLC的一项重要应用。除甘氨酸外,其它氨基酸均存在手性异构体,并且在生物体内主要以L构型存在,而D-氨基酸只存在于细菌细胞壁肽聚糖的复合物和肽类抗生素中[29]。L-氨基酸也可以通过外消旋作用转化为D-氨基酸,但这一过程相当缓慢[29, 76]。Fitznar等[77]使用OPA和手性硫醇化合物N-异丁酰-(D, L)半胱氨酸(IBLC/IBDC)与海水样品中氨基酸反应后,通过HPLC分离并用荧光检测器(Ex/Em=330 nm/445 nm)进行测定,80 min的多步梯度洗脱完成19对氨基酸手性异构体的分离,但是脯氨酸和羟基脯氨酸不参与OPA与硫醇的反应且半胱氨酸和胱氨酸衍生物的荧光强度较低。因为不易受生物降解影响,细胞壁中的大部分氨基酸更容易积累,因此氨基酸的手性异构体组成可以作为有机质降解和来源的指标[15, 36, 37]。此外,D-氨基酸可以作为细菌对DOM贡献的指标[77-79]

    • 质谱(MS, mass spectrometry)技术、单体同位素分析技术(CSIA, compound-specific isotope analysis)和毛细管电泳(CE, capillary electrophoresis)等新技术也在氨基酸分析领域有一定的应用。

      MS与GC联用以实现氨基酸的分离和定性定量分析。Broek等[80]采用GC-MS进行氨基酸的定性和定量,并将DOM的Δ14C与氨基酸摩尔丰度和D/L比结合探索“微生物氮泵”,定量了3种之前未在海水DOM被证实的D-氨基酸。虽然仍存在样品前处理繁琐费时的缺点,但是可以同时定性和定量分析极低含量的氨基酸。CSIA即利用单体氨基酸的同位素数值(CSI-AA)(δ13C和δ13N)作为标志物指示含氮物质的来源和转化,弥补了单依靠各类降解因子无法全面反应有机物在海洋中复杂的生物地球化学行为的不足,尤其是15N稳定同位素在指示有机氮在食物网、异养转换和成岩过程中的行为中具有很大的潜力[81-83]。CE是一项较新的高效液相分离技术,近年来在分离科学领域发展迅速,并被广泛的应用于食品和生物医学等领域中氨基酸及其手性异构体的分离测定[84-87]。CE技术常用于海洋领域无机离子的分析[88],但由于重现性较差在氨基酸分析中的应用较少。最新的一项研究[89]运用CE-C4D(capacitively coupled contactless conductivit -y detection)技术同时分析高盐液体(包括海水)中的无机离子和氨基酸,采用亚临界水提取(SWE, subcritical water extraction)以提高氨基酸的检测,虽然灵敏度稍差但是可以实现氨基酸的快速筛选[90]

    • 海水中溶解氨基酸的分析方法经历了不断地改进和发展,最终荧光法替代分光法成为测定的主要方法。而荧光检测技术与HPLC联用后由于其高灵敏度、快速简便和仪器简单等优点成为最常用的分析方法,并被广泛的应用于氨基酸手性异构体的测定和有机物质降解的指示研究中;质谱技术的发展实现了超低含量氨基酸定性和定量分析的同时进行,之后应该会获得更多的应用;单体同位素分析技术为氨基酸分析提供了新的思路,对有机物质降解和再合成机理研究有重要意义。今后的研究将更侧重于阐释氨基酸生物地球化学循环过程的机理研究,如降解和再合成途径等方面,因此多种手段的联用将是未来的发展趋势,如三维荧光光谱、单体同位素分析技术和核磁共振等手段结合使用以获得更多来源及迁移转化路径和规律等信息。

参考文献 (90)

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