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温度和氮、磷限制对南海一株利玛原甲藻生长和产毒的影响

仲云 吴海燕 江涛 郑关超 吕颂辉 谭志军

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温度和氮、磷限制对南海一株利玛原甲藻生长和产毒的影响

    作者简介: 仲 云(1994-),女,山东烟台人,硕士研究生,主要研究方向为海洋生物毒素风险评价,E-mail:zyn10421@126.com;
    通讯作者: 谭志军,E-mail:tanzj@ysfri.ac.cn
  • 基金项目: 国家重点研发计划资助项目(2017YFC1600701);国家自然科学基金面上项目(31772075)
  • 中图分类号: Q948.1

Effects of temperature, nitrogen and phosphorous limitation on the physiological and toxigenic characteristics of harmful benthic dinoflagellate Prorocentrum lima isolated from South China Sea

  • 摘要: 为评估我国南海海域分布的一株产毒底栖型利玛原甲藻(Prorocentrum lima, HN45株)的潜在风险,在不同温度(20 ℃、25 ℃、30 ℃)和氮、磷限制(氮磷比:4.08、8.17、16.3、24.5、73.5、147)条件下对其进行室内培养,比较了温度和氮、磷限制对该株赤潮藻的细胞数、比生长率和色素等生理特征及其腹泻性贝类毒素(diarrhetic shellfish toxins,DSTs)生产特性的影响。多因素方差分析结果表明,温度和磷限制均显著影响利玛原甲藻的细胞数、多甲藻素和大田软海绵酸(okadaic acid,OA)细胞内总毒素含量。单细胞产毒量在温度为25 ℃、磷浓度为6 μM时呈现最高值,即11.34 pg/cell。磷限制抑制了藻细胞的生长和繁殖,但显著提高了其产毒能力。研究结果显示,该株藻细胞产毒以游离态DSTs毒素为主,其相应酯化态毒素含量仅占单细胞产毒总量的3%~14%,含量远低于游离态毒素。研究还发现,利玛原甲藻所产叶绿素a(chlorophyll a,Chl a)含量随生长周期的变化与DSTs含量呈负相关,进一步证实了Chl a与DSTs存在竞争关系,这对于解析环境胁迫条件下利玛原甲藻生存策略提供了重要科学依据。
  • 图 1  不同温度和氮、磷限制下利玛原甲藻生长曲线

    Figure 1.  The growth of P. lima in different temperature, nitrogen and phosphorus limitation

    图 2  不同温度下利玛原甲藻色素总分布图和多甲藻素、Chl a及两者的比值周期变化

    Figure 2.  The pigments distribution, peridinin, chl a and peridinin/Chl ​​ a of P. lima in different temperature

    图 3  不同氮磷限制下利玛原甲藻多甲藻素和Chl a的含量变化

    Figure 3.  The peridinin and Chl a of P. lima in different nitrogen and phosphorus limitation

    图 4  不同温度下利玛原甲藻各成分胞内总毒素含量和游离态以及酯化态的比例

    Figure 4.  The toxin production of P. lima in different temperature and the proportion of free, esterified toxin

    图 5  不同氮磷限制下平台期利玛原甲藻各成分胞内毒素总含量及其比例

    Figure 5.  The toxin total content and proportion of P. lima in different nitrogen phosphorus limitation

    表 1  氮、磷限制条件各组的氮、磷浓度以及相关的氮、磷比(n=3)

    Table 1.  Nitrate and phosphate concentrations (μM) in the different growth media of nitrogen and phosphorous limited conditions and related N:P ratios (n=3)

    组分6P3P1.5PP1/3P1/6P
    NO3882882882882882882
    PO43−2161085436126
    N/P4.088.1716.324.573.5147
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    表 2  不同温度下利玛原甲藻 Logistic对数形式模型的参数与方程

    Table 2.  Parameters and equations of P. lima in different temperature by Logistic Logarithm Model

    TK/cells·mL−1ar/d−1回归方程回归系数
    20 ℃126673.348 ±0.31740.2806 ±0.0324ln [(12667−N)/N] = 3.348 − 0.2806 t0.9487
    25 ℃167673.528 ±0.49610.3239 ±0.0506ln [(16767−N)/N] = 3.528 − 0.3239 t0.9089
    30 ℃221333.664 ±0.34870.3283 ±0.0356ln [(22133−N)/N] = 3.664 − 0.3283 t0.9546
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    表 3  利玛原甲藻毒素与色素的相关性分析

    Table 3.  The correlation analysis of toxin and pigments in P. lima

    因子25 ℃磷浓度=6 μM,N/P = 147
    线性拟合方程R2Pearson’s线性拟合方程R2Pearson’s
    叶绿素ay= −0.385x+8.2060.817−0.953y= −0.385x+5.0870.933−0.983
    多甲藻素y= 2.128x+3.6760.9240.981y= 0.998x+5.9150.9490.987
    岩藻黄素y= −0.189x+4.6870.528−0.874y= −0.062x+1.8160.996−0.999
    硅甲藻黄素y= 0.269x+1.8920.7150.926y= 0.096x+1.5100.5480.880
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-08-28
  • 录用日期:  2019-11-07
  • 刊出日期:  2021-02-20

温度和氮、磷限制对南海一株利玛原甲藻生长和产毒的影响

    作者简介:仲 云(1994-),女,山东烟台人,硕士研究生,主要研究方向为海洋生物毒素风险评价,E-mail:zyn10421@126.com
    通讯作者: 谭志军,E-mail:tanzj@ysfri.ac.cn
  • 1. 上海海洋大学 海洋生态与环境学院,上海 201306
  • 2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东 青岛 266071
  • 3. 暨南大学 赤潮与海洋生物学研究中心,广东 广州 510632
  • 4. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室,山东 青岛 266237
基金项目: 国家重点研发计划资助项目(2017YFC1600701);国家自然科学基金面上项目(31772075)

摘要: 为评估我国南海海域分布的一株产毒底栖型利玛原甲藻(Prorocentrum lima, HN45株)的潜在风险,在不同温度(20 ℃、25 ℃、30 ℃)和氮、磷限制(氮磷比:4.08、8.17、16.3、24.5、73.5、147)条件下对其进行室内培养,比较了温度和氮、磷限制对该株赤潮藻的细胞数、比生长率和色素等生理特征及其腹泻性贝类毒素(diarrhetic shellfish toxins,DSTs)生产特性的影响。多因素方差分析结果表明,温度和磷限制均显著影响利玛原甲藻的细胞数、多甲藻素和大田软海绵酸(okadaic acid,OA)细胞内总毒素含量。单细胞产毒量在温度为25 ℃、磷浓度为6 μM时呈现最高值,即11.34 pg/cell。磷限制抑制了藻细胞的生长和繁殖,但显著提高了其产毒能力。研究结果显示,该株藻细胞产毒以游离态DSTs毒素为主,其相应酯化态毒素含量仅占单细胞产毒总量的3%~14%,含量远低于游离态毒素。研究还发现,利玛原甲藻所产叶绿素a(chlorophyll a,Chl a)含量随生长周期的变化与DSTs含量呈负相关,进一步证实了Chl a与DSTs存在竞争关系,这对于解析环境胁迫条件下利玛原甲藻生存策略提供了重要科学依据。

English Abstract

  • 利玛原甲藻(Prorocentrum lima)是一种广泛分布于热带、亚热带和温带水域的海洋底栖有毒赤潮藻[1-2],主要产生大田软海绵酸(okadaic acid,OA)和鳍藻毒素(dinophysistoxins,DTXs)等腹泻性贝类毒素(diarrhetic shellfish toxins,DSTs),可对近海生态和食品安全造成严重影响[3-5],因而受到国际社会的重点关注[6-7]。研究表明,利玛原甲藻在自然条件下的生长和产毒极易受到外界环境变化的影响。温度、营养盐、盐度和光照等因素在不同程度上影响藻细胞的生理活性和产毒能力[8-9],其中,温度和营养盐的改变对单细胞产毒能力的影响最为显著。温度可影响利玛原甲藻细胞代谢和碱性磷酸酶的活性,使其生长速率、最大藻密度和胞内毒素含量产生变化。研究指出,利玛原甲藻具有较强的环境温度适应性,可以在5 ℃~30 ℃内生长。Wang等[10]研究发现,利玛原甲藻单细胞中OA和DTX-1的含量在30 ℃时呈现最高值,但是此温度不利于藻细胞的生长,说明温度对藻细胞生长和产毒机制的影响存在差异性。另外,海洋环境中营养盐的变化可影响藻类群落结构和生物量以及浮游植物的生物化学组成[11]。氮、磷限制虽会抑制细胞基础代谢、改变色素组成和降低光合效率,但更有利于藻细胞中DSTs的合成和积累,其中磷限制下单细胞产毒能力强于氮限制,说明磷元素对藻细胞产毒的影响更显著[12]。此外,利玛原甲藻通过合成胞内毒素等次级代谢产物应对外界环境压力,从而形成一种竞争补偿策略[13]。因此,研究温度和氮、磷限制对利玛原甲藻生长和产毒的影响至关重要,这有助于理解环境压力下藻细胞的生态功能和适应机制。

    本研究选择分离自我国南海海域的一株利玛原甲藻HN45株为研究对象,设置3组温度(20 ℃、25 ℃、30 ℃)和6组氮、磷限制条件(N/P= 4.08、8.17、16.3、24.5、73.5、147),通过分析28 d生长周期中藻细胞的细胞数、比生长率、色素及其毒素(游离态毒素和酯化态毒素)组成和含量变化,确定该株有毒藻最适生长和产毒的温度;在此基础上探究氮、磷限制对其生长和产毒的影响,进而探索藻细胞体内游离态毒素和酯化态毒素的毒性及DSTs各组分的相互转化规律。

    • 利玛原甲藻(Prorocentrum lima,HN45株)于2015年分离自我国南海海域(19°37′57′′N,110°58′32′′E),由暨南大学赤潮与海洋生物学研究中心提供,实验室内f/2-Si培养基[14]进行培养,温度为25 ℃,光照强度为125 μmol /(m2·s),盐度28~32,光暗周期为12 h∶12 h。

    • (1)色素标准品:叶绿素 a (Chl a)、脱镁叶绿素 a (Phe a)、二乙烯基叶绿素 a (DV chl a)、叶绿素 b (Chl b)、叶绿素 c 2 (Chl c 2)、叶绿素 c 3 (Chl c 3)、Mg DVP、多甲藻素 (Peri)、脱镁叶绿酸 a (Pheidea)、19’-己酰基氧化岩藻黄素 (Hex-Fuco)、19’-丁酰基氧化岩藻黄素 (But-Fuco)、岩藻黄素 (Fuco)、新叶黄素 (Neo)、青绿黄素 (Pras)、紫黄素 (Viola)、硅甲藻黄素 (Diadino)、硅藻黄素 (Diato)、别藻黄素(Allo)、玉米黄素 (Zea)、叶黄素 (Lut)、角黄素 (Cantha)、β-胡萝卜素 (β, β-Car) ,均购自丹麦DHI 公司。

      DSP标准品:OA[C44H68O13,(8.4±0.4) μg/mL,m/z=805.4733];DTX-2[C44H68O13,(3.8±0.2) μg/mL,m/z=805.4733];DTX-1[C45H70O13,(8.5±0.7) μg/mL,m/z=819.4889],均购自加拿大国家研究理事会海洋生物科学研究所(CRM)。

      (2)化学试剂:甲醇、乙腈和丙酮(HPLC级,美国Merck公司);甲酸铵(HPLC级,美国Sigma Aldrich公司);盐酸、氢氧化钠(优级纯,国药);吡啶(色谱纯,Duksan Pure Chemicals);冰醋酸(分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司);植物可溶性糖检测试剂盒和总蛋白定量测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。其他未作特殊说明的试剂均为分析纯,实验用水为超纯水(18.2 MΩ. cm)。

    • 共设置温度和氮、磷限制实验组,每个条件均设置3组平行。其中温度实验设置为20 ℃、25 ℃和30 ℃ 3个变化温度,其他条件同1.1节;氮、磷限制实验在f/2-Si培养基的基础上固定NO3浓度,进行磷浓度调节,温度恒定为25 ℃,共设置6组实验(表1),其他条件同1.1节。

      组分6P3P1.5PP1/3P1/6P
      NO3882882882882882882
      PO43−2161085436126
      N/P4.088.1716.324.573.5147

      表 1  氮、磷限制条件各组的氮、磷浓度以及相关的氮、磷比(n=3)

      Table 1.  Nitrate and phosphate concentrations (μM) in the different growth media of nitrogen and phosphorous limited conditions and related N:P ratios (n=3)

      分别在藻细胞缓慢生长期、指数生长期和平台期收集藻液,用于色素和毒素测定。取20 mL藻液经47 mm Whatman GF/F(0.7 μm)玻璃纤维膜过滤,将滤膜剪碎后放入盛有3 mL 95%甲醇的聚乙烯离心管中,冰浴超声5 min,上清液过0.22 μm滤膜用于色素测定。取30 mL藻液8000 r/min离心5 min,用于毒素的测定。

    • 初始接种密度为500 cells/mL,接种后,每隔3 d(固定时间)取样,充分摇匀后取5 mL藻液于离心管中,加100 μL鲁格试剂(Lugol′s solution)固定[15],在TE100倒置显微镜(Nikon E100)下用浮游植物计数框计数,记录细胞密度。

      (1)比生长率测定,一般通过比生长率的变化来反映藻类的生长变化,以下式表示比生长率(μ)。

      式中:µ为比生长率,/d;N2为培养时间t2的藻细胞密度,cells/mL;N1为培养时间t1的藻细胞密度,cells/mL;t2为对应的培养时间,d;t1为对应的培养时间,d。

      (2)生长曲线拟合,以Logistic方程的对数形式拟合藻类的增长过程,计算方程可用式(2)表达[16]

      式中:K为最大藻细胞密度,cells/mL;N为培养时间t的藻细胞密度,cells/mL;a为曲线截距;t为培养时间;r为内禀增长率,/d。首先进行参数估计,将最大藻细胞密度(Xmax)作为 K的估计值,以最小二乘法进行回归分析,获得该方程的截距和斜率作为 ar 的估计值。

    • 采用液相色谱-紫外法分析藻细胞中的22种色素组成,包括Chl a、多甲藻素、岩藻黄素和硅甲藻黄素等辅助色素,方法参照Zapata等[17]。色谱柱为Waters Symmetry C8柱(150×4.6 mm,3.5 μm,10 nm孔径),柱温为25 ℃,流速为1 mL/min,进样量为100 µL。流动相中A相为甲醇∶乙腈∶吡啶/醋酸溶液(体积比为50∶25∶25),其中吡啶/醋酸溶液的配制方法为900 mL超纯水中加入20 mL吡啶和10 mL冰醋酸,调pH至5.0,超纯水定容至1 L后0.45 μm混合膜过滤。B相为甲醇∶乙腈∶丙酮(体积比为20∶60∶20),流动相梯度洗脱程序为0~22 min,40% B;28~38 min,95% B;40~45 min,0% B。

    • 胞内游离毒素提取,方法参照Quilliam[18],收集藻细胞加入2 mL 80%甲醇,低温超声破碎10 min,离心取上清液并氮吹至干,用5 mL甲醇复溶,过0.22 μm滤膜待测游离DSTs。胞内总毒素提取:取上述提取液于进样小瓶中,加入125 μL 2.5 mol/L氢氧化钠,涡旋后于76 ℃加热40 min,取出后迅速流水冷却至室温,加入125 μL 2.5 mol/L盐酸中和并混匀,过0.22 μm滤膜后待测胞内总毒素。

      DSTs毒素分析色谱条件:色谱柱为Kinetex-C8柱(150 mm× 2.1 mm,2.6 µm);柱温为40 ℃;流速为0.35 mL/min;进样量取10 µL;流动相分为A相和B相,A相为水(2 mmol/L甲酸铵和50 mmol/L甲酸),B相为95%乙腈水溶液(2 mmol/L甲酸铵和50 mmol/L甲酸)。流动相梯度洗脱程序:0~0.50 min为80% A相;5.00~13.00 min为10% A相;13.1~15 min为80% A相。

      DSTs毒素分析质谱条件:扫描模式为Full MS/dd-MS2正离子模式,Full MS采集范围取m/z 600~1500,分步碰撞能量为10 eV和30 eV。DSTs毒素标准曲线的浓度范围为5~500 ng/mL。毒素成分浓度根据公式(3)计算:

      式中:X为最终样品藻细胞的毒素浓度,pg/cells;C1为测定样品藻细胞的毒素浓度,ng/mL;V1为样品提取剂体积,mL;C2为样品藻细胞密度,cells/mL;V2为样品藻液体积,mL。

    • 实验数据采用origin Pro 8.5.1和SPSS 19.0软件进行数据处理。采用多因素方差分析方法和F检验分析比较各环境因子不同条件对利玛原甲藻生长和产毒影响的显著性,按概率(p<0.05)设置显著性检验阈值。

    • 不同温度和氮、磷限制条件下藻细胞的生长趋势如图1所示,其在20 ℃、25 ℃和30 ℃的生长参数及拟合方程如表2所示。应用多因素方差方法分析3种温度下的藻密度,发现不同温度下藻细胞的生长情况存在显著差异(p<0.05)。如图1A所示,30 ℃的藻密度始终高于其他两个温度,并且20 d时藻密度(2.2×104 cells/mL)达到最大,分别是25 ℃和20 ℃的1.32倍和1.93倍。结合表2可知,30 ℃时藻细胞的r值最高,为0.3283 /d,反映出藻细胞在30 ℃时的增殖能力最强。如图1B,氮限制组的最高藻密度(2.05×104 cells/mL)高于磷限制组,而且r值在各处理组中差异显著(p<0.05),添加216 μM磷元素的实验组(6P)的r值最高,为0.2634 /d,是最低值的1.23倍,然而磷限制组组内r值无明显差异(p>0.05)。

      图  1  不同温度和氮、磷限制下利玛原甲藻生长曲线

      Figure 1.  The growth of P. lima in different temperature, nitrogen and phosphorus limitation

      TK/cells·mL−1ar/d−1回归方程回归系数
      20 ℃126673.348 ±0.31740.2806 ±0.0324ln [(12667−N)/N] = 3.348 − 0.2806 t0.9487
      25 ℃167673.528 ±0.49610.3239 ±0.0506ln [(16767−N)/N] = 3.528 − 0.3239 t0.9089
      30 ℃221333.664 ±0.34870.3283 ±0.0356ln [(22133−N)/N] = 3.664 − 0.3283 t0.9546

      表 2  不同温度下利玛原甲藻 Logistic对数形式模型的参数与方程

      Table 2.  Parameters and equations of P. lima in different temperature by Logistic Logarithm Model

      利用液相色谱-紫外法分析得到,利玛原甲藻含有Chl a和3种辅助色素(多甲藻素、硅甲藻黄素和岩藻黄素)。如图2A所示,多甲藻素和Chl a是藻细胞主要色素,两者含量分别占总色素的56.10%和16.80%,其次是岩藻黄素和硅甲藻黄素。如图2B图2C所示,多甲藻素随生长周期逐渐增加,而Chl a随生长周期变化与其相反,两者含量分别在25 ℃平台期和缓慢生长期呈现最高值,分别为24.08 pg/cell和7.36 pg/cell,是最低含量(30 ℃)的1.43倍和1.56倍。另外多甲藻素/Chl a随生长周期递增,在25 ℃实验组的比值(5.10)显著低于20 ℃(6.37)和30 ℃(10.83),此温度下的Chl a含量最高,说明利玛原甲藻参与光合作用中酶的活性在25 ℃最高,更有利于Chl a的生物合成。比较氮、磷限制实验组中多甲藻素和Chl a含量,发现单细胞多甲藻素在磷限制组的含量高于氮限制组,并在1/3P处理组达到最高,为18.73 pg/cell(图3)。而单细胞Chl a含量则在氮限制组更高,这说明培养液中氮、磷元素的缺乏不同程度上限制了色素的合成,磷限制促进多甲藻素的合成而抑制Chl a的合成。

      图  2  不同温度下利玛原甲藻色素总分布图和多甲藻素、Chl a及两者的比值周期变化

      Figure 2.  The pigments distribution, peridinin, chl a and peridinin/Chl ​​ a of P. lima in different temperature

      图  3  不同氮磷限制下利玛原甲藻多甲藻素和Chl a的含量变化

      Figure 3.  The peridinin and Chl a of P. lima in different nitrogen and phosphorus limitation

      温度和氮、磷浓度是影响利玛原甲藻生长的最基本环境因子。研究表明,利玛原甲藻最高藻密度和最大瞬时比生长率均出现在30 ℃,但其Chl a和多甲藻素含量却在25 ℃呈现最高值,说明藻细胞在不同温度会产生不同的生理生态响应,这与利玛原甲藻原分离海域(19°37′57′′N,110°58′32′′E)的温度及地域差异导致的基因多样性有关。氮、磷营养元素常被用来预测藻密度的变化和季节演替, 成为藻细胞暴发时间和孢囊萌发速度的关键因素之一[19],磷限制会显著抑制胞内ATP的合成和H+-ATP酶的活性,从而影响藻细胞的增殖[20]。在营养限制胁迫下,藻细胞的生长均受到抑制,但具有一定差异,其中磷限制组(PO43− = 6 μM和12 μM)的藻密度显著低于对照组,氮限制组的藻密度和对照组无显著差异,这说明磷限制对藻细胞的生长抑制作用较大。同样,在磷限制胁迫条件下中肋骨条藻的细胞生长受到抑制,但东海原甲藻可以利用胞内存储的磷元素进行生长和繁殖[21],显示出不同藻种对磷元素的耐受机制与补偿生长存在差异。色素通常用来表征藻类生物量变化,而辅助色素与Chl a的比值也能反映藻细胞的生理状态,研究表明藻细胞的辅助色素与Chl a的比值随藻细胞进入平台期而呈上升趋势[22],这与本实验的结果相同。藻细胞在生长后期为免受强光抑制而促进多甲藻素的合成,从而降低了藻细胞的光补集复合体和PSII的活性,导致多甲藻素与Chl a的比值随生长周期逐渐增加。藻细胞的光合作用在25 ℃时较强,有利于Chl a合成酶的表达调控,使25 ℃时的比值显著低于20 ℃和30 ℃。因此,多甲藻素与Chl a比值越低,表示藻细胞生长状态越好。氮、磷元素参与藻细胞的光合作用和细胞代谢过程,所以培养基中氮、磷元素的缺乏必然影响细胞色素的合成。与氮限制不同的是,磷元素的缺乏降低了藻细胞合成Chl a的效率但增加了单细胞内多甲藻素的含量,这可能与藻细胞体内各生物组分的合成机制有关,未来可以结合藻细胞内各色素含量来推测调查海域环境中营养盐的变化。

    • 产毒影响方面,分离自南海的利玛原甲藻主要产生OA、DTX-1和35S DTX-1三种DSTs成分,其中35S DTX-1是DTX-1的同分异构体[23],其质荷比、特征离子碎片(183、237、301、319)和脱水峰(801、783、765、747、729和 711)均与DTX-1相同。如图4A、图4B图4C,OA、DTX-1和35S DTX-1胞内总毒素含量在平台期达到最高,而且OA胞内总毒素含量受温度影响差异显著(p<0.05),并在25 ℃达到最高,占比超过90%,而DTX-1和35S DTX-1则不足10%。

      图  4  不同温度下利玛原甲藻各成分胞内总毒素含量和游离态以及酯化态的比例

      Figure 4.  The toxin production of P. lima in different temperature and the proportion of free, esterified toxin

      图4D所示,酯化态毒素占总毒素比例的3%~14%,最高比例出现在25 ℃,其含量虽远低于游离态毒素,但仍是藻细胞总DSTs的重要组成部分。如图5所示,单细胞毒素含量随氮、磷比增加大体呈升高趋势。氮限制组的单细胞胞内总毒素含量高于对照组(P),但是其组内3个处理组对藻细胞产毒能力影响不显著。磷限制对藻细胞OA胞内总毒素含量影响显著(p<0.05),并且在1/6P组的含量最高(9.68 pg/cell),是对照组的1.48倍,这表明磷限制可以提高藻细胞单细胞产毒能力。另外,胞内OA和35S DTX-1比例随周期增长而增加,但DTX-1从13%降到5%。

      图  5  不同氮磷限制下平台期利玛原甲藻各成分胞内毒素总含量及其比例

      Figure 5.  The toxin total content and proportion of P. lima in different nitrogen phosphorus limitation

      研究表明,利玛原甲藻主要含有OA、DTX-1和35S DTX-1三种毒素成分,其中OA胞内总毒素含量受温度和磷限制影响差异显著,其含量在温度为25 ℃和磷浓度为6 μM时最高,为11.34 pg/cell,占比超过90%。低磷浓度虽会抑制藻细胞分裂并干扰其代谢规律,但是磷限制会促进藻细胞体积增大,同时合成毒素的速率不变,所以单细胞内毒素含量会增加,这与Vanucci[13]的研究结果相同。研究表明,利玛原甲藻储存营养盐的能力强于硅藻和其他甲藻,同时产生毒素防止浮游生物的摄食,从而形成一种补偿性竞争策略。OA与DTX-1的比值可以反映不同藻株所产毒素的差异性,本实验中 OA与DTX1的比值为14.78,比Nascimento[24]研究中的比值小4倍,但高于Aquino[25]研究中的比值(OA/DTX-1=1.7~3.4),显示出藻细胞主要毒素成分为OA毒素,同时说明利玛原甲藻在不同地区的产毒含量及其种株差异显著。研究还发现DTX-1与35S DTX-1占总毒素的比例随生长周期不同呈现不同趋势,基于两者是同分异构体的原因,推测DTX-1在毒素形成过程中可能会部分转化为35S DTX-1。另外,利玛原甲藻为防止DSTs抑制叶绿体内丝氨酸/苏氨酸蛋白酶的活性,通过光介导作用将体内DTX-4和DTX-5等水溶性毒素转移到周围的液泡中,转化成二酯基后并进一步生成游离态毒素[11]。利玛原甲藻胞内总毒素含量大于胞内游离毒素含量,说明藻细胞体内含有酯化态毒素,体内酯化态毒素是其存储毒素的一种形式,藻细胞会通过毒素的转化与释放来应对外界环境压力的变化,所以对其毒性及存在形式的研究有助于评价利玛原甲藻总体毒素的风险性。

    • 综合分析温度和氮、磷限制对藻细胞毒素和色素的相关性得到毒素与Chl a及岩藻黄素呈负相关关系,与多甲藻素等其他指标呈正相关。藻细胞在25 ℃时胞内总毒素含量由3.70 pg/cell(缓慢生长期)增加到11.21 pg/cell(平台期),而Chl a含量则由7.36 pg/cell降到4.71 pg/cell。如表3所示,25 ℃时毒素与Chl a含量的Pearson相关系数为0.953,表现一定的负相关性。而多甲藻素含量随生长周期增长而增加,与毒素变化一致,相关系数为0.981。磷限制实验组也表现出同样的关联性。

      因子25 ℃磷浓度=6 μM,N/P = 147
      线性拟合方程R2Pearson’s线性拟合方程R2Pearson’s
      叶绿素ay= −0.385x+8.2060.817−0.953y= −0.385x+5.0870.933−0.983
      多甲藻素y= 2.128x+3.6760.9240.981y= 0.998x+5.9150.9490.987
      岩藻黄素y= −0.189x+4.6870.528−0.874y= −0.062x+1.8160.996−0.999
      硅甲藻黄素y= 0.269x+1.8920.7150.926y= 0.096x+1.5100.5480.880

      表 3  利玛原甲藻毒素与色素的相关性分析

      Table 3.  The correlation analysis of toxin and pigments in P. lima

      Chl a是藻细胞体内反应的中心光合色素,多甲藻素等其他辅助色素只起到捕获、传递光能和防止光损伤的作用。相关性分析表明,胞内毒素总量与Chl a、多甲藻素和岩藻黄素的相关性最高,胞内毒素总含量和多甲藻素含量随生长周期而增加,而Chl a含量则与其相反。前人研究证明,利玛原甲藻藻细胞中DSTs和叶绿素均在叶绿体内产生,所以其单细胞产毒量与叶绿素含量密切相关[26]。Needham[27]等人利用同位素标记法研究DTX-4和OA二醇酯的生物合成中发现DSTs结构中的碳原子来源于乙酸盐和乙醇酸盐。藻细胞DSTs与Chl a的合成能量源于叶绿体卡尔文循环中的葡萄糖,两者的前体物质分别是甘氨酸和谷氨酸[28]。本实验推测藻细胞在生长前期更多利用外源有机质中谷氨酸合成Chl a,但随着其大量繁殖,水体中溶解氧降低,藻细胞残体中的磷元素释放到水体中,同时经过一系列反应使合成毒素的底物增加,最终单细胞毒素含量升高。因此,利玛原甲藻毒素和Chl a的合成可能存在相互竞争的关系。

    • 温度和氮、磷限制影响利玛原甲藻(Prorocentrum lima, HN45株)的生理特征及其DSTs生产特性。温度和磷限制对利玛原甲藻的细胞数、色素含量和毒素成分影响显著,藻细胞最适生长温度为30 ℃,单细胞最佳产毒温度为25 ℃,其体内所产生的DSTs与Chl a的周期变化呈负相关,进一步证实了两者存在竞争关系。磷限制(NO3= 882 μM,PO43− = 6 μM)虽会抑制藻细胞的生长,但可提高其单细胞产毒能力。由此可见,利玛原甲藻在营养盐胁迫条件下可以通过产生毒素形成一种补偿性竞争策略。另外,通过研究酯化态毒素的毒性和存在形式并探明其与游离态毒素的转化关系,有助于进一步评价南海海域利玛原甲藻的潜在生态风险。

参考文献 (28)

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