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北部湾卡盾藻(Chattonella spp.)种类鉴定

徐轶肖 何喜林 张腾 刘仁沿 赵志娟

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北部湾卡盾藻(Chattonella spp.)种类鉴定

    作者简介: 徐轶肖(1977-),女,浙江兰溪人,博士,副研究员,主要从事海洋有毒有害藻与海产品安全研究,E-mail:xuyixiao_77@163.com;
  • 基金项目: 国家自然科学基金项目(41976155,41506137);广西自然科学基金项目(2020GXNSFDA297001,2016GXNSFBA380037)
  • 中图分类号: Q178.53

Identification of strains of Chattonella spp. from the Beibu Gulf

  • 摘要: 2018年9月在北部湾海域分离得到3株卡盾藻,采用光学显微镜对其进行形态学初步鉴定,并通过核糖体大亚基LSU rDNA和ITS基因进行系统进化分析。结果表明,卡盾藻北部湾株符合海洋卡盾藻形态学典型特征:藻体黄褐色,细胞呈纺锤形,无黏液泡,尾部具尖端,细胞平均长(57.8±9.1)μm。系统发育树上北部湾卡盾藻分别以96%(LSU rDNA)和99%(ITS)的自展支持率与不同来源的海洋卡盾藻、古老卡盾藻、卵圆卡盾藻、小型卡盾藻聚在同一大分支上。通过遗传距离分析发现,北部湾3株卡盾藻与不同来源的海洋卡盾藻、古老卡盾藻、卵圆卡盾藻、小型卡盾藻亲缘关系较近,LSU和ITS遗传距离分别为0.0000~0.0016和0.0000~0.0235;而与盐生卡盾藻亲缘关系较远,遗传距离分别为0.0415~0.0490和0.0733~0.0750。因此,综合形态学和分子生物学结果可以确定北部湾3株卡盾藻为海洋卡盾藻/海洋卡盾藻的变种。研究结果可为我国卡盾藻藻华藻种库的构建和卡盾藻北部湾株生理生态学的研究提供基础数据。
  • 图 1  北部湾卡盾藻S2-2018-Ch-1的显微镜图

    Figure 1.  Microscopy of Chattonella sp.(S2-2018-Ch-1)in the Beibu Gulf

    图 2  基于LSU rDNA序列构建的卡盾藻系统发育树(最大似然法)

    Figure 2.  The Maximum Likelihood(ML)phylogenetic tree based on LSU rDNA sequences of Chattonella spp.

    图 3  基于ITS序列构建的卡盾藻系统发育树(最大似然法)

    Figure 3.  The Maximum Likelihood(ML)phylogenetic tree based on ITS sequences of Chattonella spp.

    表 1  样品信息

    Table 1.  Sampling information

    株系采集地采集时间
    S2-2018-Ch-1北部湾Beibu Gulf(21°02′51″N,109°08′43″E)2018-09-15
    S2-2018-Ch-2北部湾Beibu Gulf(21°02′51″N,109°08′43″E)2018-09-15
    S6-2018-Ch-1北部湾Beibu Gulf(21°01′53″N,109°04′53″E)2018-09-15
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    表 2  卡盾藻LSU rDNA和ITS基因序列

    Table 2.  LSU rDNA and ITS sequences of Chattonella

    基因株系来源登录号
    Chattonella sp.S2-2018-Ch-1Beibu Gulf, China中国北部湾MT421781
    Chattonella sp.S2-2018-Ch-2Beibu Gulf, China中国北部湾MT421782
    Chattonella sp.S6-2018-Ch-1Beibu Gulf, China中国北部湾MT421783
    C. marinaMS-3-PAB217639
    C. marinaDY_bayDeungnyang Bay, Korea韩国双阳湾MK257155
    C. marinaG-12Japan 日本AB217638
    C. marinaCCMP2049Kagoshima, Japan 日本鹿儿岛JX067557
    C. antiquaCCMP2052Aichi, Japan 日本爱知县JX067556
    LSUC. antiquaNIES-558Mikawa Bay, Japan 日本三河湾AB217632
    C. antiquaNIES-1Japan 日本AB217631
    C. antiquaNIES-86Japan 日本AB217868
    C. ovataNIES-603Japan 日本AB217640
    C. ovataovata-PJapan日本AB217641
    C. minimaNIES848Japan日本AB286928
    C. subsalsaCCMP217KR709212
    C. subsalsaPHIL493Bolinao, Philippines 菲律宾波里瑙LC415433
    Chattonella sp.S2-2018-Ch-1Beibu Gulf, China中国北部湾MT421777
    Chattonella sp.S2-2018-Ch-2Beibu Gulf, China中国北部湾MT421778
    Chattonella sp.S6-2018-Ch-1Beibu Gulf, China中国北部湾MT421779
    C. marinaCCMP2049Kagoshima, Japan日本鹿儿岛JX067592
    C. marinaC1601IDNIndonesia印度尼西亚LC384989
    C. marinaC. TomasUSA 美国AY858862
    C. marinaHong Kong, China 中国香港AY704165
    C. antiquaNIES-558Mikawa Bay, Japan 日本三河湾AB286922
    ITSC. antiquaCCMP2052Aichi, Japan 日本爱知县JX067591
    C. antiquaNIES161Hiroshima Bay, Japan日本广岛湾AB286914
    C. antiquaKA-59-aJapan日本AB286906
    C. ovataNIES-603Japan 日本AB334345
    C. ovataHong Kong, China 中国香港AY704166
    C. minimaNIES848Japan 日本AB286928
    C. subsalsaPHIL493Bolinao, Philippines菲律宾波里瑙LC415433
    C. subsalsaPHIL494Bolinao, Philippines菲律宾波里瑙LC415434
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    表 3  基于形态学的卡盾藻种类鉴定[3]

    Table 3.  Identification of Chattonella spp. on the basis of morphology[3]

    细胞形态特征种类
    1 a. 有黏液泡2
    1 b. 无黏液泡3
    2 细胞细长,尾部具尖端C. subsalasa
    3 a. 细胞呈卵形C. ovata
    3 b. 细胞不呈卵形,尾部具尖端4
    4 a. 细胞长度为20~50 µmC. minima
    4 b. 细胞长度为35~70 µmC. marina
    4 c. 细胞长度为50~130 µm且有明显的尖尾C. antiqua
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    表 4  卡盾藻属LSU rDNA和ITS基因序列组成统计

    Table 4.  Statistics of LSU rDNA and ITS gene sequence of Chattonella spp.

    基因保守位点可变位点简约信息位点单态位点转换/颠换比碱基平均含量/(%)
    ATGC
    LSU1402363062.022.928.228.420.5
    ITS6256750172.026.624.023.625.8
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    表 5  部分卡盾藻LSU rDNA序列遗传距离矩阵

    Table 5.  Genetic distance matrix based on LSU rDNA sequences among Chattonella spp.

    序号株名12345678910111213
    1Chattonella sp.S2-2018-Ch-1
    2Chattonella sp.S2-2018-Ch-20.0000
    3Chattonella sp.S6-2018-Ch-10.00000.0000
    4C. marinaCCMP20490.00000.00000.0000
    5C. antiquaNIES-5580.00000.00000.00000.0000
    6C. ovataNIES-6030.00000.00000.00000.00000.0000
    7C. minimaNIES8480.00000.00000.00000.00000.00000.0000
    8C. subsalasaPHIL4930.04150.04150.04150.05140.04600.04600.0474
    9V. globosuseNIWA10080.48580.48580.48580.49300.48580.48580.48580.4669
    10P. verruculosaver-P0.47770.47770.47770.48930.47770.47770.47770.47590.2416
    11H. akashiwoOF34010.21860.21860.21860.22110.21860.21860.22020.22130.45550.4459
    12F. japonicaCCMP16610.31610.31610.31610.30840.31610.31610.31610.32910.48950.45770.3236
    13O. luteusNIES-150.39600.39600.39600.40700.39600.39600.39600.40610.46220.51840.41350.3775
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    表 6  部分卡盾藻ITS序列遗传距离矩阵

    Table 6.  Genetic distance matrix based on ITS sequences among Chattonella spp.

    序号株名12345678910111213
    1Chattonella sp.S2-2018-Ch-1
    2Chattonella sp.S2-2018-Ch-20.0015
    3Chattonella sp.S6-2018-Ch-10.00150.0000
    4C. marinaCCMP20490.00190.00190.0019
    5C. antiquaNIES-5580.00150.00150.00150.0000
    6C. ovataNIES-6030.00000.00000.00000.00190.0018
    7C. minimaNIES8480.00150.00000.00150.00190.00150.0000
    8C. subsalasaPHIL4930.07500.07330.07480.09200.07710.08780.0731
    9V. globosuseNIWA10080.95500.95500.95500.84250.95500.87440.95500.9493
    10P. verruculosaver-P1.02321.02321.02320.82671.01150.87831.02321.04430.7028
    11H. akashiwo0.20000.20000.20000.23190.20230.22380.20000.17970.91140.9833
    12F. japonicaFJAR04020.81250.81430.81250.62300.79930.68880.81430.86110.88290.97740.8192
    13O. luteusNIES-150.81630.81490.81600.65880.80370.69650.81460.80370.87921.01760.80620.9862
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  • [1] ONITSUKA G, YAMAGUCHI M, SAKAMOTO S, et al. Interannual variations in abundance and distribution of Chattonella cysts, and the relationship to population dynamics of vegetative cells in the Yatsushiro Sea, Japan[J]. Harmful Algae, 2020, 96: 101833. doi: 10.1016/j.hal.2020.101833
    [2] 廖姿蓉, 王朝晖. 海洋卡盾藻与三种典型海洋硅藻的种间竞争研究[J]. 海洋环境科学, 2019, 38(3): 321-327. doi: 10.12111/j.mes20190301
    [3] IMAI I, YAMAGUCHI M. Life cycle, physiology, ecology and red tide occurrences of the fish-killing raphidophyte Chattonella[J]. Harmful Algae, 2012, 14: 46-70. doi: 10.1016/j.hal.2011.10.014
    [4] 齐雨藻, 洪 英, 吕颂辉, 等. 南海大鹏湾海洋褐胞藻赤潮及其成因[J]. 海洋与湖沼, 1994, 25(2): 132-138. doi: 10.3321/j.issn:0029-814X.1994.02.003
    [5] 周 健, 王 玮, 吴志宏, 等. 山东沿海赤潮灾害基本特征及防控对策建议[J]. 海洋环境科学, 2020, 39(4): 537-543. doi: 10.12111/j.mes.20190043
    [6] SONG X K, SHI Y J, SUN Y Z, et al. First record of the harmful Raphidophyte Chattonella marina bloom in Rushan coast, China in 2008 after the occurrence of the green tide[J]. Advanced Materials Research, 2013, 663: 911-921. doi: 10.4028/www.scientific.net/AMR.663.911
    [7] 田 媛, 李 涛, 胡思敏, 等. 广东省沿岸海域藻华发生的时空特征[J]. 海洋环境科学, 2020, 39(1): 1-8. doi: 10.12111/j.mes20200101
    [8] 郭 皓, 林凤翱, 刘永健, 等. 近年来我国海域多发性赤潮生物种类以及赤潮风险指数分级预警方法[J]. 海洋环境科学, 2014, 33(1): 94-98.
    [9] HARA Y, DOI K, CHIHARA M. Four new species of Chattonella (Raphidophyceae, Chromophyta) from Japan[J]. Japanese Journal of Phycology, 1994, 42: 407-420.
    [10] HOSOI-TANABE S, OTAKE I, SAKO Y. Phylogenetic analysis of noxious red tide flagellates Chattonella antiqua, C. marina, C. ovata, and C. verruculosa (Raphidophyceae) based on the rRNA gene family[J]. Fisheries Science, 2006, 72(6): 1200-1208. doi: 10.1111/j.1444-2906.2006.01277.x
    [11] HOSOI-TANABE S, HONDA D, FUKAYA S, et al. Proposal of Pseudochattonella verruculosa gen. nov., comb. nov. (Dictyochophyceae) for a formar raphidophycean alga Chattonella verruculosa, based on 18S rDNA phylogeny and ultrastructural characteristics[J]. Phycological Research, 2007, 55(3): 185-192. doi: 10.1111/j.1440-1835.2007.00461.x
    [12] CHANG F H, MCVEAGH M, GALL M, et al. Chattonella globosa is a member of Dictyochophyceae: reassignment to Vicicitus gen. nov., based on molecular phylogeny, pigment composition, morphology and life history[J]. Phycologia, 2012, 51(4): 403-420. doi: 10.2216/10-104.1
    [13] XU Y X, ZHANG T, ZHOU J. Historical occurrence of algal blooms in the Northern Beibu Gulf of China and implications for future trends[J]. Frontiers in Microbiology, 2019, 10: 451. doi: 10.3389/fmicb.2019.00451
    [14] 姜发军, 陈 波, 何碧娟, 等. 广西钦州湾浮游植物群落结构特征[J]. 广西科学, 2012, 19(3): 268-275. doi: 10.3969/j.issn.1005-9164.2012.03.018
    [15] HIRASHITA T, ICHIMI K, MONTANI S, et al. Molecular analysis of ribosomal RNA gene of red tide algae obtained from the Seto Inland Sea[J]. Marine Biotechnology, 2000, 2(3): 267-273. doi: 10.1007/s101269900034
    [16] KAI A K L, CHEUNG Y K, YEUNG P K K, et al. Development of single-cell PCR methods for the Raphidophyceae[J]. Harmful Algae, 2006, 5(6): 649-657. doi: 10.1016/j.hal.2006.01.002
    [17] 徐轶肖, 何喜林, 张 腾, 等. 北部湾棕囊藻藻华原因种分析[J]. 热带海洋学报. 2020, 39(6): 122-130.
    [18] KLÖPPER S, JOHN U, ZINGONE A, et al. Phylogeny and morphology of a Chattonella (Raphidophyceae) species from the Mediterranean Sea: what is C. subsalsa?[J]. European Journal of Phycology, 2013, 48(1): 79-92. doi: 10.1080/09670262.2013.771412
    [19] 陈月琴, 屈良鹄. 海洋亚历山大藻属种间界定的分子标准[J]. 中山大学学报: 自然科学版, 1999, 38(1): 7-11.
    [20] HALLEGRAEFF G M, HARA Y. Taxonomy of harmful marine raphidophytes[M]//HALLEGRAEFF G M, ANDERSON D M, CEREBELLA A D. Manual on Harmful Marine Microalgae. Paris: UNESCO, 1995: 511–522.
    [21] DEMURA M, NOËL M H, KASAI F, et al. Taxonomic revision of Chattonella antiqua, C. marina and C. ovata (Raphidophyceae) based on their morphological characteristics and genetic diversity[J]. Phycologia, 2009, 48(6): 518-535. doi: 10.2216/08-98.1
    [22] ATTARAN-FARIMAN G, BOLCH C J S. Morphology and genetic affinities of a novel Chattonella isolate (Raphidophyceae) isolated from Iran's South coast (Oman Sea)[J]. Turkish Journal of Botany, 2014, 38: 156-168. doi: 10.3906/bot-1210-33
    [23] BRANCO S, ALMEIDA L L, ALVES-DE-SOUZA C, et al. Morphological and genetic characterization of bloom-forming Raphidophyceae from Brazilian coast[J]. Phycological Research, 2019, 67(4): 279-290. doi: 10.1111/pre.12377
    [24] 王红霞, 陆斗定, 何飘霞, 等. 东海三叶原甲藻(Prorocentrum triestinum)的形态特征及其ITS序列分析[J]. 海洋学报, 2012, 34(4): 155-162.
    [25] 陈婉婉. 近盐骨条藻的形态、分类及生理研究[D]. 上海: 上海师范大学, 2019: 28–29.
  • [1] 田媛李涛胡思敏谢学东刘胜 . 广东省沿岸海域藻华发生的时空特征. 海洋环境科学, 2020, 39(1): 1-8. doi: 10.12111/j.mes20200101
    [2] 曹雪峰陈波侍茂崇郭佩芳石洪源 . 北部湾水文气象极值参数研究. 海洋环境科学, 2017, 36(4): 495-500. doi: 10.13634/j.cnki.mes.2017.04.003
    [3] 梁采莹王朝晖郭鑫刘磊 . 环北部湾典型港湾表层沉积物中生源要素分布特征. 海洋环境科学, 2017, 36(5): 648-654. doi: 10.13634/j.cnki.mes.2017.05.002
    [4] 陈洁吴霓姚宝龙黄华梅王静章柳立王金华 . 应用海洋健康指数对环北部湾中国近岸海洋健康的评价. 海洋环境科学, 2019, 38(6): 868-873. doi: 10.12111/j.mes20190608
    [5] 王朝晖马长江许忠能 . 中国东南沿海四株亚历山大藻的系统发育研究. 海洋环境科学, 2015, 34(1): 1-5,35. doi: 10.13634/j.cnki.mes.2015.01.001
    [6] 廖姿蓉王朝晖 . 海洋卡盾藻与三种典型海洋硅藻的种间竞争研究. 海洋环境科学, 2019, 38(3): 321-327. doi: 10.12111/j.mes20190301
    [7] 姚焕玫龚祝清钟炜萍纳泽林韦毅明 . 广西北部湾海域初级生产力与环境因子相关关系研究. 海洋环境科学, 2021, 40(2): 242-249. doi: 10.12111/j.mes.20200014
    [8] 田义超黄鹄张强陶进张亚丽梁铭忠周国清韩鑫林俊良杨永伟 . 基于蜂巢格网的北部湾典型海岛景观生态风险空间异质性研究. 海洋环境科学, 2021, 40(4): 527-534, 541. doi: 10.12111/j.mes.20200004
    [9] 郑华敏张建兵周游游胡宝清黄腾霄严志强 . 北部湾城市群海洋环境与经济发展耦合特征及其时空格局分析. 海洋环境科学, 2019, 38(5): 681-689. doi: 10.12111/j.mes20190506
    [10] 王锚婷王朝晖雷明丹刘磊 . 冰藻在北冰洋生态系统中的重要性及其对全球变暖的响应. 海洋环境科学, 2021, 40(4): 550-554. doi: 10.12111/j.mes.20200087
    [11] 常雪晴黄伟李卓卿王星火马路阔王有基 . 基于简化基因组测序的三门湾海域无脊椎动物的遗传多样性分析. 海洋环境科学, 2021, (): 1-6. doi: 10.12111/j.mes.20200362
    [12] 胡恒于腾孟范平杜秀萍李祥蕾 . 5种多溴联苯醚同系物对海洋饵料藻(亚心型扁藻和盐生杜氏藻)的急性毒性. 海洋环境科学, 2015, 34(5): 654-660. doi: 10.13634/j.cnki.mes.2015.05.003
    [13] 梁英孙明辉刘春强田传远 . 氮源对三角褐指藻、盐藻和米氏凯伦藻生长和种间竞争的影响. 海洋环境科学, 2015, 34(1): 29-35. doi: 10.13634/j.cnki.mes.2015.01.006
    [14] 杨琳刘磊许道艳李冬梅刘仁沿梁玉波 . 海洋微藻溶血毒素化学结构研究进展. 海洋环境科学, 2016, 35(4): 628-634. doi: 10.13634/j.cnki.mes.2016.04.024
    [15] 刘湘庆姜美洁刘璐李艳张学雷李瑞香王宗灵 . 浒苔藻体叶绿素提取方法的比较. 海洋环境科学, 2016, 35(1): 144-148. doi: 10.13634/j.cnki.mes.2016.01.023
    [16] 马婉捷王小冬王艳 . 海洋尖尾藻选择性摄食研究. 海洋环境科学, 2018, 37(3): 332-337. doi: 10.12111/j.cnki.mes20180303
    [17] 魏雨婷王艳王小冬 . 海洋尖尾藻的营养升级功能研究. 海洋环境科学, 2020, 39(3): 329-333. doi: 10.12111/j.mes20200301
    [18] 杨斌石静田力徐雯佳 . 秦皇岛海域微微藻褐潮遥感监测方法初探. 海洋环境科学, 2016, 35(4): 605-610. doi: 10.13634/j.cnki.mes.2016.04.020
    [19] 石新国李悦肖宇淳郑文煌刘乐冕陈剑锋 . 中肋骨条藻高效溶藻菌FDHY-C3的分离鉴定及溶藻作用研究. 海洋环境科学, 2021, 40(1): 114-121. doi: 10.12111/j.mes.20190276
    [20] 张偲陈晓华谭丽菊王江涛 . 纳米TiO2对中肋骨条藻和杜氏盐藻的毒性效应研究. 海洋环境科学, 2018, 37(2): 215-220, 227. doi: 10.12111/j.cnki.mes20180209
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-06-08
  • 录用日期:  2020-07-24
  • 刊出日期:  2021-06-20

北部湾卡盾藻(Chattonella spp.)种类鉴定

    作者简介:徐轶肖(1977-),女,浙江兰溪人,博士,副研究员,主要从事海洋有毒有害藻与海产品安全研究,E-mail:xuyixiao_77@163.com
  • 1. 南宁师范大学 北部湾环境演变与资源利用教育部重点实验室,广西 南宁 530001
  • 2. 南宁师范大学 广西地表过程与智能模拟重点实验室,广西 南宁 530001
  • 3. 国家海洋环境监测中心,辽宁 大连 116023
  • 4. 南宁师范大学 环境与生命科学学院,广西 南宁 530001
基金项目: 国家自然科学基金项目(41976155,41506137);广西自然科学基金项目(2020GXNSFDA297001,2016GXNSFBA380037)

摘要: 2018年9月在北部湾海域分离得到3株卡盾藻,采用光学显微镜对其进行形态学初步鉴定,并通过核糖体大亚基LSU rDNA和ITS基因进行系统进化分析。结果表明,卡盾藻北部湾株符合海洋卡盾藻形态学典型特征:藻体黄褐色,细胞呈纺锤形,无黏液泡,尾部具尖端,细胞平均长(57.8±9.1)μm。系统发育树上北部湾卡盾藻分别以96%(LSU rDNA)和99%(ITS)的自展支持率与不同来源的海洋卡盾藻、古老卡盾藻、卵圆卡盾藻、小型卡盾藻聚在同一大分支上。通过遗传距离分析发现,北部湾3株卡盾藻与不同来源的海洋卡盾藻、古老卡盾藻、卵圆卡盾藻、小型卡盾藻亲缘关系较近,LSU和ITS遗传距离分别为0.0000~0.0016和0.0000~0.0235;而与盐生卡盾藻亲缘关系较远,遗传距离分别为0.0415~0.0490和0.0733~0.0750。因此,综合形态学和分子生物学结果可以确定北部湾3株卡盾藻为海洋卡盾藻/海洋卡盾藻的变种。研究结果可为我国卡盾藻藻华藻种库的构建和卡盾藻北部湾株生理生态学的研究提供基础数据。

English Abstract

  • 卡盾藻(Chattonella)隶属于针胞藻纲(Raphidophyceae),曾用中文名褐胞藻,在世界各主要海域均有分布。该藻是一种鱼毒性藻华种,形成藻华时会对鱼类产生毒害作用,而且会分泌溶血性毒素,导致鱼血红细胞发生溶血作用,严重危害沿岸海洋环境、养殖业和滨海景观[1-2]。卡盾藻藻华自1969年在日本广岛被发现以来,于日本海域频繁发生,之后在挪威、美国和澳大利亚等海域也发现了该藻藻华[3]。1991年3月,在我国广东省大鹏湾首次记录到卡盾藻暴发的藻华,持续时间为36 h,范围约0.12 km2[4]。之后在我国渤海、黄海、南海海域多次发生卡盾藻藻华[5-7],近年来,海洋卡盾藻(Chattonella marina)已成为我国海域主要的易发性赤潮生物种[8]

    根据细胞大小、细胞形状和叶绿体的显微结构等形态特征可将卡盾藻属分为7个种类,即海洋卡盾藻(C. marina)、古老卡盾藻(C. antiqua)、盐生卡盾藻(C. subsalsa)、球型卡盾藻(C. globosa)、卵圆卡盾藻(C. ovata)、小型卡盾藻(C. minima)和疣突卡盾藻(C. verruculosa[9]。然而卡盾藻属细胞形态相似,且形态特征可能会随着环境条件而改变[10],通过传统的形态学不足以进行种类区分。分子鉴定技术的快速发展,为探讨海洋微藻分类提供了新的手段,18S rDNA基因序列和细胞超微结构分析表明,C. verruculosa不属于针胞藻纲(Raphidophyceae),而被移到硅鞭藻纲(Dictyochophyceae),并改名为Pseudochattonella verruculosa[11]。核糖体基因SSU rDNA、LSU rDNA、ITS和线粒体编码的COI基因的系统发育分析表明,C. globosa也属于硅鞭藻纲(Dictyochophyceae),并重新命名为Vicicitus globosus[12]。因此,目前普遍认为卡盾藻属包含5个种类,即海洋卡盾藻、古老卡盾藻、盐生卡盾藻、卵圆卡盾藻和小型卡盾藻。

    北部湾是我国大西南地区重要的海上通道,近年来,北部湾藻华发生频率、持续时间、规模以及有害藻华种类均明显增加[13]。虽然目前在北部湾未报道卡盾藻藻华,但该藻是世界广布种,中国大部分海域发生过该藻藻华事件[8],北部湾海域一旦条件适宜极有可能发生卡盾藻藻华,对当地水产养殖业构成威胁。此前有学者基于光学显微镜指出广西钦州湾存在海洋卡盾藻[14],考虑到仅仅依靠形态学对卡盾藻种层次区分困难,为获取北部湾该藻分子生物学分类数据,并进一步明确其种类归属,2018年9月在北部湾赤潮高发区涠洲岛海域[13]采集浮游植物水样,分离纯化3株卡盾藻,综合光学显微技术和基于LSU rDNA、ITS特征序列构建的系统发育树确定种类,探讨北部湾卡盾藻的分类学地位及与其他海域卡盾藻的亲缘关系。结果可为我国北部湾藻华的灾害防治研究提供生物学基础数据。

    • 藻种来自2018年9月广西北部湾涠洲岛海域(表1),样品采集、运输、贮存参照《海洋监测规范》(GB/T 17378—2007)进行。样品带回实验室,在倒置显微镜(TS100, Nikon)下,用毛细管从水样中分离挑选卡盾藻细胞株,经灭菌海水洗涤后逐级扩大培养获纯培养株,培养条件为f/2培养基、21℃、光强150 μE/(m2·s)、光暗比14 h∶10 h,藻种培养至指数生长期早期,收集用于提取DNA。

      株系采集地采集时间
      S2-2018-Ch-1北部湾Beibu Gulf(21°02′51″N,109°08′43″E)2018-09-15
      S2-2018-Ch-2北部湾Beibu Gulf(21°02′51″N,109°08′43″E)2018-09-15
      S6-2018-Ch-1北部湾Beibu Gulf(21°01′53″N,109°04′53″E)2018-09-15

      表 1  样品信息

      Table 1.  Sampling information

    • 由于卡盾藻固定后细胞形态容易发生变化,本实验采用活体藻细胞在光学显微镜(TS100, Nikon)下直接观察。吸取适量藻液在载玻片上,光镜下观察藻细胞并用拍照软件拍照(NIS-Elements D 4.50.00)。此外,用荧光染料SYBR Green1(上海源叶生物科技有限公司)对卡盾藻细胞核染色,在荧光显微镜(Ni-U, Nikon)下以450~490 nm蓝光激发观察并拍照。

    • 取指数生长期藻液2.0 mL在7000×g下离心1 min,倒掉上清液,应用杭州博日BioFastSpin植物基因组DNA提取试剂盒对卡盾藻藻液提取DNA,以提取的总DNA为模板进行LSU rDNA、ITS特征片段PCR扩增。LSU rDNA序列扩增正向引物为(5′-ACCCGCTGAATTTAAGCATA-3′),反向引物为(5′-CCTTGGTCCGTGTTTCAAGA-3′)[15];ITS序列扩增正向引物为(5′-GGTGAAGTCGTAACAAGGTTTCCG-3′),反向引物为(5′-CCCGCTTCACTCGCCGTTAC-3′)[16]。PCR反应条件[17]包括17 µL ddH2O,20 µL的2×Es Taq Master Mix,DNA模板1 µL,正、反向引物各1 µL。PCR反应程序:94℃预变性5 min;然后94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸30 s,共35个循环;最后72℃延伸5 min。PCR产物送到北京擎科新业生物技术有限公司测序,用Seqman软件对序列进行拼接,序列结果上传到GenBank 中,获得各序列的基因登录号(表2)。

      基因株系来源登录号
      Chattonella sp.S2-2018-Ch-1Beibu Gulf, China中国北部湾MT421781
      Chattonella sp.S2-2018-Ch-2Beibu Gulf, China中国北部湾MT421782
      Chattonella sp.S6-2018-Ch-1Beibu Gulf, China中国北部湾MT421783
      C. marinaMS-3-PAB217639
      C. marinaDY_bayDeungnyang Bay, Korea韩国双阳湾MK257155
      C. marinaG-12Japan 日本AB217638
      C. marinaCCMP2049Kagoshima, Japan 日本鹿儿岛JX067557
      C. antiquaCCMP2052Aichi, Japan 日本爱知县JX067556
      LSUC. antiquaNIES-558Mikawa Bay, Japan 日本三河湾AB217632
      C. antiquaNIES-1Japan 日本AB217631
      C. antiquaNIES-86Japan 日本AB217868
      C. ovataNIES-603Japan 日本AB217640
      C. ovataovata-PJapan日本AB217641
      C. minimaNIES848Japan日本AB286928
      C. subsalsaCCMP217KR709212
      C. subsalsaPHIL493Bolinao, Philippines 菲律宾波里瑙LC415433
      Chattonella sp.S2-2018-Ch-1Beibu Gulf, China中国北部湾MT421777
      Chattonella sp.S2-2018-Ch-2Beibu Gulf, China中国北部湾MT421778
      Chattonella sp.S6-2018-Ch-1Beibu Gulf, China中国北部湾MT421779
      C. marinaCCMP2049Kagoshima, Japan日本鹿儿岛JX067592
      C. marinaC1601IDNIndonesia印度尼西亚LC384989
      C. marinaC. TomasUSA 美国AY858862
      C. marinaHong Kong, China 中国香港AY704165
      C. antiquaNIES-558Mikawa Bay, Japan 日本三河湾AB286922
      ITSC. antiquaCCMP2052Aichi, Japan 日本爱知县JX067591
      C. antiquaNIES161Hiroshima Bay, Japan日本广岛湾AB286914
      C. antiquaKA-59-aJapan日本AB286906
      C. ovataNIES-603Japan 日本AB334345
      C. ovataHong Kong, China 中国香港AY704166
      C. minimaNIES848Japan 日本AB286928
      C. subsalsaPHIL493Bolinao, Philippines菲律宾波里瑙LC415433
      C. subsalsaPHIL494Bolinao, Philippines菲律宾波里瑙LC415434

      表 2  卡盾藻LSU rDNA和ITS基因序列

      Table 2.  LSU rDNA and ITS sequences of Chattonella

    • 将获得的3株卡盾藻LSU rDNA、ITS基因序列在NCBI的GenBank数据库进行BLAST同源性检测,下载与物种相关并同源性较高的序列,其中藻株CCMP2052、NIES-558、CCMP2049、NIES-603、PHIL493、NIES848同时具有LSU rDNA、ITS基因序列(表2)。序列通过MEGA-X软件进行人工校对,统计碱基组成、保守位点、变异位点、简约分析的信息位点、单态位点、转换/颠换比,并基于Kimura2-parameter计算遗传距离,采用最大似然法(Maximum Likelihood, ML)构建系统发育树。

    • 由于北部湾3株藻细胞形态、大小相似,故仅对藻株S2-2018-Ch-1拍照描述。在光学显微镜下,藻体呈黄褐色,藻细胞裸露无壁,呈纺锤形, 背腹纵扁,腹面中央具一条纵沟,细胞具两条鞭毛。细胞长39.2~71.6 µm,平均值(57.8±9.1)µm(n=50),宽25.9~38.2 µm,平均值(31.2±2.9)µm(n=50)。细胞尾部具尖端,无黏液泡,细胞内部含大量色素体,由中心向四周作辐射状排列(图1A)。细胞经荧光染料染色后,可看见位于细胞中央的大型细胞核(图1B)。参考2012年Imai等[3]的基于形态学卡盾藻种类鉴定表(表3),初步鉴定北部湾3株卡盾藻为海洋卡盾藻。

      图  1  北部湾卡盾藻S2-2018-Ch-1的显微镜图

      Figure 1.  Microscopy of Chattonella sp.(S2-2018-Ch-1)in the Beibu Gulf

      细胞形态特征种类
      1 a. 有黏液泡2
      1 b. 无黏液泡3
      2 细胞细长,尾部具尖端C. subsalasa
      3 a. 细胞呈卵形C. ovata
      3 b. 细胞不呈卵形,尾部具尖端4
      4 a. 细胞长度为20~50 µmC. minima
      4 b. 细胞长度为35~70 µmC. marina
      4 c. 细胞长度为50~130 µm且有明显的尖尾C. antiqua

      表 3  基于形态学的卡盾藻种类鉴定[3]

      Table 3.  Identification of Chattonella spp. on the basis of morphology[3]

    • 北部湾3株卡盾藻LSU rDNA和ITS序列长度分别约为1438 bp和692 bp,LSU rDNA序列中A、T、G、C碱基的平均含量分别为24.3%、26.2%、28.7%、20.8%,A+T的含量(50.5%)>G+C的含量(49.5%);ITS序列中A、T、G、C碱基的平均含量分别为24.8%、25.4%、27.8%、22.0%,A+T的含量(51.2%)>G+C的含量(48.8%)。本文建树所用卡盾藻属(包括北部湾株)的LSU rDNA和ITS序列碱基平均含量与各类位点信息见表4。可见,北部湾3株卡盾藻碱基平均含量与卡盾藻属平均含量(表4)接近,该藻属LSU rDNA序列可变位点少于ITS序列,而保守位点多于ITS序列,两种序列转换/颠换比相同,均为2.0。

    • 分别以硅藻纲(Bacillariophyceae)的新月细柱藻(Cylindrotheca closterium)和甲藻纲(Dinophyceae)的红色赤潮藻(Akashiwo sanguinea)为外类群,构建LSU rDNA和ITS序列系统发育树。发现北部湾3株卡盾藻与世界不同海域的卡盾藻聚成一大分支,自展值分别为99和65(图2图3),其中一小分支为盐生卡盾藻(C. subsalsa),自展值为100和99,而另一小分支为本文3株卡盾藻与不同来源的海洋卡盾藻(C. marina)、古老卡盾藻(C. antiqua)、卵圆卡盾藻(C. ovata)、小型卡盾藻(C. minima)聚在一起,同源性较高,自展值分别为96和99。针胞藻纲内,与卡盾藻属亲缘关系最近的藻属是异弯藻属(Heterosigma),其次是Fibrocapsa,而与Olisthodiscus的亲缘关系较远。同时,两种系统发育树上均可以看出V. globosus(原C. globosa)和P. verruculosa(原C. verruculosa)与硅鞭藻纲(Dictyochophyceae)下的其他种聚在一起,自展值分别为98和67。

      图  2  基于LSU rDNA序列构建的卡盾藻系统发育树(最大似然法)

      Figure 2.  The Maximum Likelihood(ML)phylogenetic tree based on LSU rDNA sequences of Chattonella spp.

      图  3  基于ITS序列构建的卡盾藻系统发育树(最大似然法)

      Figure 3.  The Maximum Likelihood(ML)phylogenetic tree based on ITS sequences of Chattonella spp.

      基因保守位点可变位点简约信息位点单态位点转换/颠换比碱基平均含量/(%)
      ATGC
      LSU1402363062.022.928.228.420.5
      ITS6256750172.026.624.023.625.8

      表 4  卡盾藻属LSU rDNA和ITS基因序列组成统计

      Table 4.  Statistics of LSU rDNA and ITS gene sequence of Chattonella spp.

      遗传距离计算发现(表5表6),北部湾3株卡盾藻LSU rDNA和ITS序列之间的遗传距离分别为0.0000和0.0000~0.0015,与世界其他海域的卡盾藻LSU和ITS遗传距离则分别为0.0000~0.0490和0.0000~0.0750。不同卡盾藻种类间,北部湾3株卡盾藻与海洋卡盾藻、古老卡盾藻、卵圆卡盾藻、小型卡盾藻亲缘关系较近,LSU和ITS遗传距离分别为0.0000~0.0016和0.0000~0.0235;而与盐生卡盾藻亲缘关系较远,遗传距离分别为0.0415~0.0490和0.0733~0.0750。此外,与北部湾3株卡盾藻亲缘关系最近,遗传距离为0.0000的藻株有:(1)日本海域的卵圆卡盾藻NIES-603株(ITS和LSU)、卵圆卡盾藻NIES-1株、NIES-86株(LSU)、小型卡盾藻NIES848株(LSU)、古老卡盾藻CCMP2052株、KA-59-a株(ITS)、古老卡盾藻NIES-558株(LSU)、海洋卡盾藻CCMP2049株和G-12株(LSU);(2)美国海域海洋卡盾藻C. Tomas株(ITS);(3)中国香港未命名株的海洋卡盾藻(ITS)。卡盾藻属内LSU rDNA和ITS遗传距离为0.0000~0.0532和0.0000~0.1017,明显小于该属与针胞藻纲下3个近缘藻属(HeterosigmaFibrocapsaOlisthodiscus)属间的遗传距离为0.2186~0.4226和0.1797~0.8611。

      序号株名12345678910111213
      1Chattonella sp.S2-2018-Ch-1
      2Chattonella sp.S2-2018-Ch-20.0000
      3Chattonella sp.S6-2018-Ch-10.00000.0000
      4C. marinaCCMP20490.00000.00000.0000
      5C. antiquaNIES-5580.00000.00000.00000.0000
      6C. ovataNIES-6030.00000.00000.00000.00000.0000
      7C. minimaNIES8480.00000.00000.00000.00000.00000.0000
      8C. subsalasaPHIL4930.04150.04150.04150.05140.04600.04600.0474
      9V. globosuseNIWA10080.48580.48580.48580.49300.48580.48580.48580.4669
      10P. verruculosaver-P0.47770.47770.47770.48930.47770.47770.47770.47590.2416
      11H. akashiwoOF34010.21860.21860.21860.22110.21860.21860.22020.22130.45550.4459
      12F. japonicaCCMP16610.31610.31610.31610.30840.31610.31610.31610.32910.48950.45770.3236
      13O. luteusNIES-150.39600.39600.39600.40700.39600.39600.39600.40610.46220.51840.41350.3775

      表 5  部分卡盾藻LSU rDNA序列遗传距离矩阵

      Table 5.  Genetic distance matrix based on LSU rDNA sequences among Chattonella spp.

      序号株名12345678910111213
      1Chattonella sp.S2-2018-Ch-1
      2Chattonella sp.S2-2018-Ch-20.0015
      3Chattonella sp.S6-2018-Ch-10.00150.0000
      4C. marinaCCMP20490.00190.00190.0019
      5C. antiquaNIES-5580.00150.00150.00150.0000
      6C. ovataNIES-6030.00000.00000.00000.00190.0018
      7C. minimaNIES8480.00150.00000.00150.00190.00150.0000
      8C. subsalasaPHIL4930.07500.07330.07480.09200.07710.08780.0731
      9V. globosuseNIWA10080.95500.95500.95500.84250.95500.87440.95500.9493
      10P. verruculosaver-P1.02321.02321.02320.82671.01150.87831.02321.04430.7028
      11H. akashiwo0.20000.20000.20000.23190.20230.22380.20000.17970.91140.9833
      12F. japonicaFJAR04020.81250.81430.81250.62300.79930.68880.81430.86110.88290.97740.8192
      13O. luteusNIES-150.81630.81490.81600.65880.80370.69650.81460.80370.87921.01760.80620.9862

      表 6  部分卡盾藻ITS序列遗传距离矩阵

      Table 6.  Genetic distance matrix based on ITS sequences among Chattonella spp.

    • 本文观察到卡盾藻北部湾株藻体呈黄褐色、细胞无黏液泡、尾部具尖端和细胞平均长(57.8±9.1)µm等特点与海洋卡盾藻典型形态学特征相符,可以初步鉴定北部湾3株卡盾藻为海洋卡盾藻。光学显微镜下盐生卡盾藻与海洋卡盾藻形态学上很相似,有无黏液泡是区分二者的重要特征,最近Klöppe等[18]发现盐生卡盾藻CCMP217株也没有黏液泡,这为两者的区分带来了困难。不过本文同时结合LSU rDNA和ITS系统发育树可以明确区分这两种卡盾藻(图2图3)。因此,对卡盾藻仅仅通过传统的显微观察,很难准确鉴定种类,需借助分子生物学手段。LSU rDNA和ITS基因序列进化速率较高,对藻类的鉴定具有重要的参考价值,特别是ITS序列,是目前国际上普遍认可的生物种水平分类的分子标记参考[19]。本文所用的卡盾藻LSU rDNA序列的可变位点少于ITS序列,而保守位点多于ITS序列,说明ITS序列的变异性高,更适合种间距离较近的卡盾藻分类。

      目前对于卡盾藻属下的海洋卡盾藻、古老卡盾藻和卵圆卡盾藻是否为3个种有争议。这3个种细胞大小有一定差距,但在形态上十分相似,即使是纯培养的种也很难将它们区分开,因此有学者认为这三者可能是一个复合种[20]。Demura等[21]通过形态学和基于ITS rDNA、rbcL、COI、微卫星序列对不同种类的卡盾藻研究,提出将古老卡盾藻和卵圆卡盾藻归属于海洋卡盾藻的变种,这一修订与最近许多学者的种类研究相符合[18, 22-23]。结合本文LSU rDNA和ITS系统发育树的拓扑结构,北部湾3株卡盾藻与不同来源的海洋卡盾藻、古老卡盾藻、卵圆卡盾藻聚成一支,分支内无其他小分支拓扑结构,北部湾3株卡盾藻应属于海洋卡盾藻/海洋卡盾藻变种。此外,我们发现小型卡盾藻与北部湾卡盾藻以及不同来源的海洋卡盾藻、古老卡盾藻、卵圆卡盾藻也聚在同一分支,与北部湾株的LSU rDNA遗传距离为0.0000,ITS遗传距离为0.0000~0.0015,但目前小型卡盾藻NCBI可用的序列很少,仅有一株rDNA基因序列,小型卡盾藻是否也属于海洋卡盾藻的变种还有待进一步研究。

      北部湾海洋卡盾藻与其他地理来源不同的海洋卡盾藻、古老卡盾藻、卵圆卡盾藻的LSU rDNA种间遗传距离为0.0000~0.0016,种间遗传差异分化小,远小于其他一些微藻种间距离。例如,海洋原甲藻(Prorocentrum micans)与三角棘原甲藻(P. triestinum)的LSU rDNA 序列遗传距离0.118,与微小原甲藻(P. minimum)遗传距离为0.101[24],曼氏骨条藻(Skeletonema munzelii)与格里斯骨条藻(S. grethae)LSU rDNA 序列遗传距离为0.01~0.02[25]。类似地,以上3种卡盾藻ITS遗传距离0.0000~0.0235与陈月琴等[19]得出的微藻类ITS 序列的种间核苷酸差异值应大于0.2也不一致。因此,卡盾藻北部湾株与不同地理来源海洋卡盾藻、古老卡盾藻、卵圆卡盾藻的LSU rDNA、ITS序列遗传差异处于种内差异水平,它们应属于同一种。

    • 本文对北部湾海域采集的3株卡盾藻株进行了种类鉴定,应用光学显微技术和基于LSU rDNA、ITS特征序列构建的系统发育树确定该3株卡盾藻为海洋卡盾藻/海洋卡盾藻的变种,它们与不同来源的海洋卡盾藻、古老卡盾藻、卵圆卡盾藻、小型卡盾藻之间亲缘关系较近,与盐生卡盾藻亲缘关系较远。

参考文献 (25)

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