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基于简化基因组测序的三门湾海域无脊椎动物的遗传多样性分析

常雪晴 黄伟 李卓卿 王星火 马路阔 王有基

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基于简化基因组测序的三门湾海域无脊椎动物的遗传多样性分析

    作者简介: 常雪晴(2000-),女,安徽合肥人,本科生,水产养殖专业,E-mail:1527947751@qq.com;
    通讯作者: 王有基,男,博士,教授,E-mail:youjiwang2@gmail.com
  • 基金项目: 国家重点研发计划项目(2018YFD0900901;2019YFD0901101);国家自然科学基金项目(42076169);中国亚太经合组织合作基金(2029901);卫星海洋环境动力学国家重点实验室自主课题重点项目(No.SOEDZZ1902)

Genetic diversity analysis of invertebrates in the Sanmen bay area based on restriction site-associated DNA sequencing

  • 摘要: 本研究通过简化基因组测序(2b-RAD)技术,对浙江省三门湾海域定居性优势无脊椎动物(哈氏仿对虾、口虾蛄、脊尾白虾、三疣梭子蟹、曼氏无针乌贼、棒锥螺和牡蛎)进行遗传结构和遗传多样性分析,以评估三门湾海域水生无脊椎动物资源现状,并为渔业可持续发展提供物种遗传资源监测依据。7个物种共获得12336~108139个SNP位点,变异位点比例为0.168%~1.571%。遗传分析结果显示,7个物种的平均核苷酸多样性(Pi)为0.147~0.306,平均观测杂合度(Ho)为0.142~0.289,多态信息含量(Polymorphism Information Content,PIC)为0.124~0.234,个体间平均遗传距离为0.118~0.246。本研究表明,三门湾水域7种代表性无脊椎动物中,生物群体变异位点比例较低,遗传多样性水平较低,且相同种群个体间的遗传分化较小, 结合本次对三门湾海域渔业资源调查分析,这可能与人工增殖放流等因素有关。
  • 图 1  三门湾生物遗传多样性调查站位

    Figure 1.  Sampling stations of biological genetic diversity in the Sanmen bay

    表 1  SNP分型结果及突变类型特点

    Table 1.  SNP typing results and characteristics of mutation types

    种类个体数量SNP位点数参考序列数变异位点比例转换颠换转换/颠换R
    哈氏仿对虾 13 108139 383242 1.05% 64599 43540 1.4837
    口虾蛄 15 12336 217990 0.17% 7945 4391 1.8094
    脊尾白虾 10 42114 297277 0.52% 24985 17129 1.4586
    三疣梭子蟹 15 85304 325007 0.97% 55583 29721 1.8702
    曼氏无针乌贼 8 39388 400123 0.36% 23442 15946 1.4701
    棒锥螺 10 90601 213613 1.57% 54209 36392 1.4896
    牡蛎 10 33174 80684 1.52% 18544 14630 1.2675
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    表 2  三门湾海域7种无脊椎动物群体遗传变异的评估

    Table 2.  Evaluation of population genetic variation of seven invertebrates in the Sanmen bay

    种类哈温平衡
    p值(HW-P)
    观测
    杂合度(Ho
    期望
    杂合度(He
    多态信息
    含量(PIC
    核苷酸
    多样性(Pi
    观测等位
    基因数(Na
    有效等位
    基因数(Ne
    遗传距离
    (1-IBS)
    哈氏仿对虾 0.74 0.1471 0.1836 0.1575 0.1916 2 1.269 0.1760
    口虾蛄 0.79 0.1421 0.1416 0.1248 0.1473 2 1.196 0.1177
    脊尾白虾 0.77 0.1688 0.1854 0.1614 0.1968 2 1.261 0.1711
    三疣梭子蟹 0.77 0.1926 0.1962 0.1659 0.2037 2 1.299 0.1675
    曼氏无针乌贼 0.70 0.2888 0.2853 0.2341 0.3061 2 1.463 0.2457
    棒锥螺 0.76 0.1981 0.2274 0.1924 0.2404 2 1.342 0.2145
    牡蛎 0.77 0.2299 0.2418 0.2018 0.2554 2 1.378 0.2168
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-12-30
  • 录用日期:  2021-05-03
  • 网络出版日期:  2021-08-11
  • 刊出日期:  2022-04-20

基于简化基因组测序的三门湾海域无脊椎动物的遗传多样性分析

    作者简介:常雪晴(2000-),女,安徽合肥人,本科生,水产养殖专业,E-mail:1527947751@qq.com
    通讯作者: 王有基,男,博士,教授,E-mail:youjiwang2@gmail.com
  • 1. 上海海洋大学 海洋生物科学国际联合研究中心 中国科学技术部,上海 201306
  • 2. 上海海洋大学 水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室,上海 201306
  • 3. 自然资源部第二海洋研究所 国家海洋局海洋生态系统与生物地球化学重点实验室,浙江 杭州 310012
基金项目: 国家重点研发计划项目(2018YFD0900901;2019YFD0901101);国家自然科学基金项目(42076169);中国亚太经合组织合作基金(2029901);卫星海洋环境动力学国家重点实验室自主课题重点项目(No.SOEDZZ1902)

摘要: 本研究通过简化基因组测序(2b-RAD)技术,对浙江省三门湾海域定居性优势无脊椎动物(哈氏仿对虾、口虾蛄、脊尾白虾、三疣梭子蟹、曼氏无针乌贼、棒锥螺和牡蛎)进行遗传结构和遗传多样性分析,以评估三门湾海域水生无脊椎动物资源现状,并为渔业可持续发展提供物种遗传资源监测依据。7个物种共获得12336~108139个SNP位点,变异位点比例为0.168%~1.571%。遗传分析结果显示,7个物种的平均核苷酸多样性(Pi)为0.147~0.306,平均观测杂合度(Ho)为0.142~0.289,多态信息含量(Polymorphism Information Content,PIC)为0.124~0.234,个体间平均遗传距离为0.118~0.246。本研究表明,三门湾水域7种代表性无脊椎动物中,生物群体变异位点比例较低,遗传多样性水平较低,且相同种群个体间的遗传分化较小, 结合本次对三门湾海域渔业资源调查分析,这可能与人工增殖放流等因素有关。

English Abstract

  • 三门湾位于浙江省东部沿海(28°57′N-29°22′N,121°25′E-121°58′E),三面环山,一面临海,是浙江省内仅次于杭州湾的第二大半封闭海湾[1]。三门湾海域面积约775 km2,海湾岸线总长304 km,其中基岩岸线186 km,湾内水深5~10 m,为海洋无脊椎动物的生长、繁衍创造了得天独厚的自然条件,现已发展为浙江省海水养殖的重要基地之一[2]

    甲壳类和贝类等无脊椎动物具有较高的经济价值以及无可替代的生态功能,被认为是我国海洋渔业资源和生态系统的重要组成部分。遗传多样性是生物多样性和生态系统多样性的基础,是生物在长期进化和发展过程中形成的自然属性,具有广泛性、特异性和适应性等特点[3]。种群的遗传多样性水平可以反映出种群对环境变化的适应能力,可为评估环境变化对种群的进化潜力和动态变化的影响提供重要借鉴[4]。此前已有渔业资源调查围绕沿海地区游泳动物的物种多样性展开研究[5-7],然而近年来三门湾海域及周边地区人类活动增多,生物群落和水域环境受到一定影响,三门湾海域渔业资源呈现出一定的衰退趋势[27]。本研究通过简化基因组测序(2b-RAD)技术,针对三门湾海域的无脊椎动物展开研究,选择海区内数量占优势,对生境影响较大,并且易于鉴定的种类,包括哈氏仿对虾(Parapenaeopsis hardwickii)、口虾蛄(Oratosquilla oratoria)、脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni de Rochebrune)、棒锥螺(Turritella bacillum)和牡蛎(Crassostrea sikmea)共7种,系统分析这些物种的核基因组遗传多样性状况和线粒体基因组的遗传多样性状况、遗传多样性和群体结构,以期为三门湾海域生物种群的分类进化、种质资源保护和海洋生态环境修复提供科学依据和背景资料。

    • 按照《建设项目对海洋生物资源影响评价技术规程》(SC/T 9110-2007)和《海洋渔业资源调查规范》(SC/T 9403-2012),于2019年8月(夏季)、11月(秋季)、2020年2月(冬季)和5月(春季),采用底拖网开展渔业资源调查。结合调查水域的实际情况设置站位,以保证调查站位的合规性和合理性,选取的30个调查站位分布于28°43′00″N-29°09′39″N,121°37′12″E-122°05′31″E(图1)。采集头足类(曼氏无针乌贼)、甲壳类(哈氏仿对虾、口虾蛄、脊尾白虾和三疣梭子蟹)和贝类(棒锥螺和牡蛎)共7种代表性无脊椎物种样本,采集后立即冷冻保存,运回实验室,用以分析生物的遗传多样性。

      图  1  三门湾生物遗传多样性调查站位

      Figure 1.  Sampling stations of biological genetic diversity in the Sanmen bay

    • 将所有样品各取肌肉30 mg,剪碎,加入200 μL DNA裂解液和5 μL 蛋白酶K,65 ℃水浴消化,每半小时振荡一次,直至完全溶解。待冷却后,加入酚氯仿200 μL,混匀后静置1 min,进行离心。取100 μL上清液,加入100 μL异丙醇并进行离心。除去上清液后加入1 mL75%乙醇,并进行离心。弃上清液后加入50 μL双蒸水混匀,通过琼脂糖检测和NanoDrop 2000紫外分光光度计(Thermo Fisher Scientific)对抽提DNA的质量和浓度进行检测。DNA产物置于−20 ℃保存备用。

      测序文库使用2b-RAD标签串联技术构建[8]。每个基因组DNA样品均用IIB型限制酶(Bsa XI)剪切,并与标准5′-NNN-3′接头连接建库。文库质量控制合格后,在Illumina Hiseq Xten平台进行Paired-end测序。

    • 从测序数据中提取含有酶切识别位点的片段,使用Stacks软件包中的ustacks软件(version 1.34)进行聚类,构建参考序列[9]。利用SOAP软件(version 2.21)将测序数据比对到参考序列[10],使用最大似然法进行位点分型[11]。利用Genepop软件(Version 1.0.5)对SNP位点的分型结果进行处理[12],得到参考序列数(Tag number)、SNP位点数和变异位点比例(SNP位点数/tag number*27 bp),并计算其有效等位基因数(Ne)、期望杂合度(He)、观测杂合度(Ho)、多态信息含量(PIC)。利用vcftools软件(Version 0.1.14)计算核苷酸多样性(Pi)和转换/颠换(Ts/Tv)的比值[13],并利用plink(v1.9)软件计算1-IBS矩阵(遗传距离)。

    • 简化基因组测序(2b-RAD)技术主要利用 IIB 型限制性内切酶,可快速进行全基因组范围高通量 SNP 筛查和分析,具有成本低,方便快捷,获得的标记数目多等优势,可以很好地应用于群体遗传多样性的分析研究[14]。为进一步评估三门湾海域生物的种群结构与资源现状,本研究利用该技术分析了三门湾7个无脊椎动物种群的遗传多样性。

      SNP分型结果中各位点的突变类型特点见表1。在7个群体中发现的变异位点(SNP位点)数为33174~108139个,变异位点比例变化范围为0.17%~1.57%。碱基转换突变的数量均高于颠换数量,转换/颠换(Ts/Tv)的变化范围为1.2675~1.8702。通过对SNP位点特征的分析发现,本次研究的4种甲壳类生物群体的变异位点比例均处于较低水平。

      种类个体数量SNP位点数参考序列数变异位点比例转换颠换转换/颠换R
      哈氏仿对虾 13 108139 383242 1.05% 64599 43540 1.4837
      口虾蛄 15 12336 217990 0.17% 7945 4391 1.8094
      脊尾白虾 10 42114 297277 0.52% 24985 17129 1.4586
      三疣梭子蟹 15 85304 325007 0.97% 55583 29721 1.8702
      曼氏无针乌贼 8 39388 400123 0.36% 23442 15946 1.4701
      棒锥螺 10 90601 213613 1.57% 54209 36392 1.4896
      牡蛎 10 33174 80684 1.52% 18544 14630 1.2675

      表 1  SNP分型结果及突变类型特点

      Table 1.  SNP typing results and characteristics of mutation types

    • 三门湾海域7种无脊椎动物的遗传多样性水平如表2所示。哈温平衡p值(HW-P)均大于0.05表明所调查的7个群体均达到了遗传平衡。观测杂合度和期望杂合度的变化范围分别为0.1421~0.2888和0.1416~0.2853,表明这7个群体的遗传多样性水平较低。多态信息含量(PIC)和核苷酸多样性(Pi)的变化范围分别为0.1248~0.2341和0.1473~0.3061,表明这7个物种遗传信息的序列间多样性较小,并且PIC均小于0.25,为低度多态,表明这7个物种的DNA变异程度较低。有效等位基因数(Ne)变化范围为1.196~1.463,表明等位基因在群体中的分布较为均匀。种群内个体间遗传距离(1-IBS)的变化范围为0.1177~0.2457,表明每个种群内个体间的遗传分化很小。

      种类哈温平衡
      p值(HW-P)
      观测
      杂合度(Ho
      期望
      杂合度(He
      多态信息
      含量(PIC
      核苷酸
      多样性(Pi
      观测等位
      基因数(Na
      有效等位
      基因数(Ne
      遗传距离
      (1-IBS)
      哈氏仿对虾 0.74 0.1471 0.1836 0.1575 0.1916 2 1.269 0.1760
      口虾蛄 0.79 0.1421 0.1416 0.1248 0.1473 2 1.196 0.1177
      脊尾白虾 0.77 0.1688 0.1854 0.1614 0.1968 2 1.261 0.1711
      三疣梭子蟹 0.77 0.1926 0.1962 0.1659 0.2037 2 1.299 0.1675
      曼氏无针乌贼 0.70 0.2888 0.2853 0.2341 0.3061 2 1.463 0.2457
      棒锥螺 0.76 0.1981 0.2274 0.1924 0.2404 2 1.342 0.2145
      牡蛎 0.77 0.2299 0.2418 0.2018 0.2554 2 1.378 0.2168

      表 2  三门湾海域7种无脊椎动物群体遗传变异的评估

      Table 2.  Evaluation of population genetic variation of seven invertebrates in the Sanmen bay

      遗传多样性是物种在长期进化过程中遗传变异和对环境适应的结果,是物种可持续生存和发展的重要基础[15]。研究种群的遗传结构和遗传分化可以更有效地保护和利用种质资源[16]。观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、多态信息含量(PIC)、核苷酸多样性(Pi)和有效等位基因数(Ne)都是衡量种群遗传多样性的重要指标[17]。本研究中三门湾海域7种无脊椎动物的群体遗传多样性参数较低,表明该海域这7种无脊椎动物的群体遗传多样性水平均较低,并且同一种类个体间的遗传分化较小,遗传结构较稳定。

      然而,本次对三门湾海域渔业资源调查却发现,游泳动物资源密度较2013年明显提升,2019年秋季以及2020年春、冬季调查游泳生物重量密度均值分别为414.92 kg/km2、311.44 kg/km2、275.32 kg/km2,均高于2013年9月、5月、1月调查值213.34 kg/km2、208.37 kg/km2、95.15 kg/km2。三门湾游泳生物重量资源密度明显增加,这可能与东海休渔期延长、休渔制度和保护措施有关。此外,资源密度的提高可能与农业部门组织的增殖放流工作的稳步实施密切相关。近年来,随着海洋环境污染问题和人类活动加剧,中国近海渔业资源日益萎缩[18]。实施人工增殖放流,在一定程度上可以缓解渔业资源衰退。然而,在人工繁育放流过程中,繁殖使用的亲本数量较少,造成有效繁殖群体较少,进而导致有效群体显著降低,可能是造成遗传多样性降低的直接原因[19]。对大西洋鲑(Salmo salar)的遗传多样性研究发现,大量放流人工培育苗种会造成遗传多样性的急剧下降[20]。海洋生物通常表现出很强的产卵能力,即有限的亲本便可繁殖大量子代,尤其在甲壳类中,如三疣梭子蟹(P. trituberculatus)存在明显的繁殖贡献不平衡现象[21]。冀萌萌等[7]于2014年 11月和 2015年 5月进行的三门湾渔业资源调查结果发现,三门湾存在大量三疣梭子蟹的产卵亲体,据此推测,三门湾可能存在三疣梭子蟹的产卵场与索饵场。本次拖网调查的结果也发现了上述现象,在多样性组成上,本次拖网调查发现2019年秋季和2020年春、冬季游泳动物渔获物生物量多样性指数(H′)均值分别为1.55、1.17、1.24,均低于2013年9月、5月、1月对应的调查数据3.08、2.43、2.60。随着人工繁殖技术大量推广,易造成当地无脊椎动物群体尤其是虾蟹类野生资源退化,遗传组成及遗传结构发生变化,遗传多样性水平降低。在紫海胆(Paracentrotus lividus)的研究中发现,养殖群体的遗传多样性显著低于野生群体,且存在较小的有效等位基因数(Ne)和紧密的亲缘关联性关系[22]。此外,环境变化影响物种的进化和多样性,由于三门湾渔业生产资料涉及浙江省台州市所辖三门县、宁波市所辖宁海县、象山县3个县,本次渔业资调查研究发现以上3个县依然存在近岸海域富营养化、养殖区域资源空间利用不合理等问题,进而导致生物群落结构和生态系统退化,这也降低了区域保持生物多样性的生态功能,在一定程度上造成了三门湾物种多样性下降,总体呈现较低水平的状态。

    • 本研究表明,三门湾水域7种代表性无脊椎动物种群中,变异位点比例均较低,并且相同种群个体间的遗传分化较小。本研究中三门湾海域7种无脊椎动物群体的遗传多样性水平均较低。结合本次对三门湾海域渔业资源调查分析,这可能与相关海域人工增殖放流、近岸海水富营养化、养殖区域资源空间利用不合理等因素有关。因此,未来需重点关注三门湾海域有关生物群体遗传多样性水平较低的现状,加强渔业种质资源保护,利用简化基因组或全基因组等技术进一步揭示生物遗传背景,开展多学科、多课题的交叉和综合研究,制定合理的渔业资源保护与利用策略。同时,注重生态环境修复,减少输入污染,保护水域生态结构和功能,保障海洋渔业的可持续发展。

参考文献 (22)

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