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  • ISSN 1007-6336
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有害甲藻米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)对海洋青鳉鱼(Oryzias melastigm)的急性毒性效应研究

严冰 岑竞仪 吕颂辉

引用本文:
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有害甲藻米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)对海洋青鳉鱼(Oryzias melastigm)的急性毒性效应研究

    作者简介: 严 冰(1994-),女,陕西咸阳人,硕士,主要研究方向为海洋毒理学,E-mail:bingyan0202@gmail.com;
    通讯作者: 岑竞仪(1984-),男,高级实验师, E-mail: jingyicen@jnu.edu.cn
  • 基金项目: 国家重点研发计划项目(2017YFC1404301);国家自然科学基金项目(41876173,41906112);科技基础资源调查专项(2018FY100200)
  • 中图分类号: X171.5

Study on the acute toxicity effects of harmful dinoflagellate Karenia mikimotoi to Oryzias melastigm

  • 摘要: 米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)是我国近岸海域常见的有毒有害藻华肇事种,能产生多种毒素,其发生藻华时会使大量鱼类或贝类死亡。本研究从细胞生物学、氧化和免疫酶活性角度研究米氏凯伦藻对海洋青鳉鱼(Oryzias melastigma)的急性毒性效应(72 h),以期揭示米氏凯伦藻对鱼类的致死原因。组织切片结果表明,高浓度的米氏凯伦藻[(1.37~1.52)×107 cells/L]可以导致海洋青鳉鱼鳃丝断裂,成团状与相邻鳃丝融合,鳃丝上皮细胞的细胞核发生偏移,并使肝细胞出现空泡化现象。高浓度的米氏凯伦藻能够抑制海洋青鳉鱼的鳃和肝组织的SOD酶活性和CAT酶活性,引起海洋青鳉鱼脂质过氧化,导致丙二醛(MDA)含量升高,对组织造成损伤。本研究结果表明,米氏凯伦藻可能通过氧化应激反应使海洋青鳉鱼的鳃和肝组织受损,为深入阐明米氏凯伦藻的毒性机制提供参考。
  • 图 1  海洋青鳉鱼的鳃以及肝的SOD活性

    Figure 1.  SOD activity of gills and liver of O. melastigm

    图 2  海洋青鳉鱼的鳃以及肝的CAT活性

    Figure 2.  CAT activity of gills and liver of O. melastigm

    图 3  海洋青鳉鱼的鳃以及肝的MDA含量

    Figure 3.  MDA activity of gills and liver of O. melastigm

    图 4  海洋青鳉鱼鳃、肠、肝脏组织切片

    Figure 4.  Tissue sections of gill, intestinal and liver for O. melastigm

    图 5  海洋青鳉鱼的肝脏基因在mRNA水平上的表达量

    Figure 5.  Expressions of liver genes at the mRNA level in the O. melastigm under control and low dose

  • [1] TOMAS C R. Identifying marine diatoms and dinoflagellates[M]. San Diego: Academic Press, 1996: 387-584.
    [2] BERGHOLTZ T, DAUGBJERG N, MOESTRUP Ø, et al. On the identity of Karlodinium veneficum and description of Karlodinium armiger sp. nov. (Dinophyceae), based on light of Phycology, 2010, 42(1): 170-193.
    [3] HIROISHI S, OKADA H, IMAI I, et al. High toxicity of the novel bloom-forming species Chattonella ovata (Raphidophyceae) to cultured fish[J]. Harmful Algae, 2005, 4(4): 783-787. doi: 10.1016/j.hal.2004.12.008
    [4] JORDAN D S, SNYDER J O. A review of the Poeciliidae or killifishes of Japan[J]. Proceedings of the United States National Museum, 1906, 31(1486): 287-290. doi: 10.5479/si.00963801.31-1486.287
    [5] SATAKE M, SHOJI M, OSHIMA Y, et al. Gymnocin-A, a cytotoxic polyether from the notorious red tide dinoflagellate, Gymnodinium mikimotoi[J]. Tetrahedron Letters, 2002, 43(33): 5829-5832. doi: 10.1016/S0040-4039(02)01171-1
    [6] DONG S J, KANG M, WU X L, et al. Development of a promising fish model (Oryzias melastigma) for assessing multiple responses to stresses in the marine environment[J]. Biomed Research International, 2014, 2014: 563131.
    [7] 安达六郎. 赤潮生物と赤潮实态[J]. 水产土木, 1973, 9(1): 31-36.
    [8] MARSHALL J A, ROSS T, PYECROFT S, et al. Superoxide production by marine microalgae[J]. Marine Biology, 2005, 147(2): 541-549. doi: 10.1007/s00227-005-1597-6
    [9] PELICANO H, CARNEY D, HUANG P. ROS stress in cancer cells and therapeutic implications[J]. Drug Resistance Updates, 2004, 7(2): 97-110. doi: 10.1016/j.drup.2004.01.004
    [10] SHIMADA M, KAWAMOTO S, NAKATSUKA Y, et al. Localization of superoxide anion in the red tide alga Chattonella antiqua[J]. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 1993, 41(4): 507-511.
    [11] MONTPYA N G, AKSELMAN R, FRANCO J, et al. Paralytic shellfish toxins and mackerel (Scomber japonicus) mortality in the Argentine Sea[J]. Harmful and toxic algal blooms, 1996, 4172: 410-426.
    [12] YAMASAKI Y, KIM D I, MATSUYAMA Y, et al. Production of superoxide anion and hydrogen peroxide by the red tide dinoflagellate Karenia mikimotoi[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2004, 97(3): 212-215. doi: 10.1016/S1389-1723(04)70193-0
    [13] YIN L Y, HUANG J Q, HUANG W M, et al. Responses of antioxidant system in Arabidopsis thaliana suspension cells to the toxicity of microcystin-RR[J]. Toxicon, 2005, 46(8): 859-864. doi: 10.1016/j.toxicon.2004.12.025
    [14] 张雨鸣. 四溴联苯醚(BDE-47)对海洋鱼类毒性和抗氧化酶活性的影响[D]. 青岛: 中国海洋大学, 2014: 657–696.
    [15] 陈 洋. DSP等赤潮藻毒素对哺乳类细胞的毒性效应及机制研究[D]. 青岛: 中国科学院海洋研究所, 2008: 56–68.
    [16] EVANS D H, PIERMARINI P M, CHOE K P. The multifunctional fish gill: dominant site of gas exchange, osmoregulation, acid-base regulation, and excretion of nitrogenous waste[J]. Physiological Reviews, 2005, 85(1): 97-177. doi: 10.1152/physrev.00050.2003
    [17] ESCOFFIER N, GAUDIN J, MEZHOUD K, et al. Toxicity to medaka fish embryo development of okadaic acid and crude extracts of Prorocentrum dinoflagellates[J]. Toxicon, 2007, 49(8): 1182-1192. doi: 10.1016/j.toxicon.2007.02.008
    [18] 潘华珍, 冯立明, 许彩民, 等. 丙二醛对红细胞的作用[J]. 生物化学与生物物理进展, 1984 (2): 34-37.
    [19] 张玉荣, 符 杰, 吴 琼, 等. 蛀食性害虫生长发育对小麦细胞膜透性及主要酶活性的影响[J]. 河南工业大学学报: 自然科学版, 2016, 37(6): 6-11.
    [20] ZHANG L M, DONG X C, WANG C G, et al. Bioaccumulation and the expression of hepatic cytochrome P450 genes in marine medaka (Oryzias melastigma) exposed to difenoconazole[J]. Journal of Environmental Sciences, 2017, 52: 98-104. doi: 10.1016/j.jes.2016.03.011
    [21] 祝学卫, 杨丽敏, 赵 霞, 等. 脂质过氧化诱导培养的内皮细胞表达白细胞介素–1[J]. 华中科技大学学报: 医学版, 2002, 31(5): 479-482.
    [22] 石真玉. 热预处理诱导的HSP70对机体抗氧化及抗损伤能力的影响[D]. 广州: 华南师范大学, 2004: 1–39.
  • [1] 陈作艺张甲波王刚刘会欣王建艳 . 2019年秦皇岛海域海洋卡盾藻赤潮与理化因子关系研究. 海洋环境科学, 2022, 41(4): 595-602. doi: 10.12111/j.mes.2021-x-0017
    [2] 张子玥杨薇孙涛舒安平冯剑丰刘海飞 . 觉华岛海域人工鱼礁生态系统能量传递与功能研究. 海洋环境科学, 2022, 41(4): 636-643. doi: 10.12111/j.mes.20210013
    [3] 李潇许艳杨璐刘书明左国成 . 世界主要国家海洋环境监测情况及对我国的启示. 海洋环境科学, 2017, 36(3): 474-480. doi: 10.13634/j.cnki.mes.2017.03.024
    [4] 赵蓓周艳荣邢聪聪刘娜娜李静康君录 . 唐山乐亭菩提岛海上风电场对海洋生态空间的影响研究. 海洋环境科学, 2022, 41(4): 496-503. doi: 10.12111/j.mes.2021-x-0270
    [5] 于兵刘子洲翟方国顾艳镇吴文凡 . 2020年夏季威海瑜泰海洋牧场底层海水溶解氧的日变化研究. 海洋环境科学, 2022, 41(4): 563-571. doi: 10.12111/j.mes.2021-x-0070
    [6] 李琛胡恒岳奇邵文宏王丙晖 . 基于海洋生态影响的液化天然气接收站取排水用海研究. 海洋环境科学, 2022, 41(4): 504-508, 518. doi: 10.12111/j.mes.2021-x-0135
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-02-08
  • 录用日期:  2021-04-17
  • 刊出日期:  2022-06-20

有害甲藻米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)对海洋青鳉鱼(Oryzias melastigm)的急性毒性效应研究

    作者简介:严 冰(1994-),女,陕西咸阳人,硕士,主要研究方向为海洋毒理学,E-mail:bingyan0202@gmail.com
    通讯作者: 岑竞仪(1984-),男,高级实验师, E-mail: jingyicen@jnu.edu.cn
  • 1. 暨南大学 生命科学技术学院,广东 广州 510632
  • 2. 水体富营养化与赤潮防治广东普通高校重点实验室,广东 广州 510632
基金项目: 国家重点研发计划项目(2017YFC1404301);国家自然科学基金项目(41876173,41906112);科技基础资源调查专项(2018FY100200)

摘要: 米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)是我国近岸海域常见的有毒有害藻华肇事种,能产生多种毒素,其发生藻华时会使大量鱼类或贝类死亡。本研究从细胞生物学、氧化和免疫酶活性角度研究米氏凯伦藻对海洋青鳉鱼(Oryzias melastigma)的急性毒性效应(72 h),以期揭示米氏凯伦藻对鱼类的致死原因。组织切片结果表明,高浓度的米氏凯伦藻[(1.37~1.52)×107 cells/L]可以导致海洋青鳉鱼鳃丝断裂,成团状与相邻鳃丝融合,鳃丝上皮细胞的细胞核发生偏移,并使肝细胞出现空泡化现象。高浓度的米氏凯伦藻能够抑制海洋青鳉鱼的鳃和肝组织的SOD酶活性和CAT酶活性,引起海洋青鳉鱼脂质过氧化,导致丙二醛(MDA)含量升高,对组织造成损伤。本研究结果表明,米氏凯伦藻可能通过氧化应激反应使海洋青鳉鱼的鳃和肝组织受损,为深入阐明米氏凯伦藻的毒性机制提供参考。

English Abstract

  • 米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)属于裸甲藻目(Gymnodiniales),凯伦藻属(Karenia),是我国近岸海域有毒有害藻华的第二大肇事藻种[1-2]。米氏凯伦藻具有溶血活性、细胞毒性、鱼毒性和胚胎毒性,其活细胞悬浮液会对皱臂轮虫产生致死效应,也会对哺乳动物血细胞产生溶血活性[3]。溶血活性能破坏生物膜的通透性,导致细胞裂解、破碎,从而使机体胚胎发育受到显著影响[4]。溶血活性和鱼毒素也会使鱼类鳃组织细胞破碎、溶解,引起鱼类的鳃丝破损,鳃小叶细胞增生肿胀,上皮细胞脱落,邻近的鳃小片基部发生融合。米氏凯伦藻还会释放活性氧(reactive oxygen species, ROS),进而破坏鱼类等生物的抗氧化能力[5]

    海洋青鳉鱼(Oryzias melastigm)具有体积小、繁殖力强、生命周期短、有性繁殖和生命阶段独特等特点,因此被用为毒理学研究的海洋鱼类模式生物。海洋青鳉鱼可用于海洋污染评估以及与心脏毒性、肝毒性、神经毒性、生态毒性、免疫毒性,和有机毒性有关的有机化学物质、无机化学物质、微生物和环境胁迫的生态毒理学研究研究[6]

    米氏凯伦藻藻华在我国近海海域发生频率较高,近年来主要在我国长江口以南的浙江沿海以及福建海域爆发,给当地渔业带来了重大的损失。我国科研人员对米氏凯伦藻赤潮的研究取得了较多的成果,大多数研究集中在米氏凯伦藻赤潮的成因分析、营养动力学、生理生态学、溶血性毒素的结构和成分等方面,而有关米氏凯伦藻对海洋生物的病理学和免疫学等方面的研究较少。本研究以模式生物——海洋青鳉鱼为研究对象,从组织病理学、免疫学方面探究米氏凯伦藻对鱼类的急性毒性效应,为深入阐明米氏凯伦藻的毒性机制提供参考。

    • 本实验所用藻株米氏凯伦藻(K.mikimotoi)于2018年分离自深圳大亚湾(株系号为KM-1),由暨南大学赤潮与海洋生物学研究中心藻种室提供。藻株用L1培养基培养,培养温度为(22 ± 2)℃,光照强度为100 µmol/m2·s,光暗周期比为12 L∶12 D。使用处于稳定期的藻细胞进行实验。

      实验所用海洋青鳉鱼亲代由香港城市大学提供。实验选用鱼为四月龄,性成熟,体重(20 ± 2)mg,外观正常,个体大小均匀,健康,反应灵敏。

    • 实验使用9个体积为3 L的玻璃鱼缸,分为对照组和实验组,各设置3个平行。根据安达六郎[7]赤潮物种浓度范围将实验组分为高浓度组[(1.46 ± 0.07)×107 cells/L]和低浓度组[(1.40 ± 0.01)×105 cells/L],对照组不添加细胞。实验于恒温光照的培养箱中进行,实验过程不间断供氧,鱼正常喂食,开展72 h急性毒性实验。实验过程中,均未出现鱼死亡情况。

    • 急性毒性实验结束后对鱼进行解剖,取出鱼的鳃和肝脏组织用波恩试剂固定,保存在4 ℃冰箱中,24 h后转移至70%的无水乙醇中脱水,随后用石蜡包埋和苏木精染色,制成切片,在光学显微镜下观察并拍照。

    • 72 h时采样分离出海洋青鳉鱼的鳃和肝脏组织,用蒸馏水冲洗干净后置于冻存管中,于−80 ℃超低温冰箱中保存。酶活性测定前解冻样品,按重量体积比加入9倍的生理盐水,制成10%的组织匀浆,−4 ℃离心30 min,转速为5000 r/min,取上清液。处理后的样品进行超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)的测定。各项指标均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒进行测定和计算。

    • 样品处理同1.4节,经过处理后的肝脏组织其细胞色素基因(cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypetide 1,CYP1A1)、白细胞介素基因(interleukin l beta,Il1β)以及热休克蛋白基因(heat shock protein 70,Hsp70)的表达量按照实时荧光定量PCR的方法进行测定。各项指标均采用明科生物技术有限公司提供的试剂盒进行测定和计算。

    • 实验数据采用Graphpad Prism软件进行统计分析,p <0.05为显著性差异。

    • 在72 h时,暴露于米氏凯伦藻高浓度组的海洋青鳉鱼鱼鳃组织中的SOD酶活性被显著抑制(p<0.05),而对照组和低浓度组没有显著差异(p>0.05,图1a)。在肝组织中,低浓度和高浓度藻细胞的添加均显著抑制了SOD酶活性(p<0.05,图1b)。鳃和肝组织中CAT酶活性显著被抑制(p<0.05),鳃组织中的抑制程度随藻细胞密度的升高而增强,而肝组织中的组间差异不明显(图2)。在高浓度组中,海洋青鳉鱼鱼鳃和肝组织内的MDA含量均高于其他组别(p<0.05,图3),表明海洋青鳉鱼脂质有过氧化反应的发生。

      图  1  海洋青鳉鱼的鳃以及肝的SOD活性

      Figure 1.  SOD activity of gills and liver of O. melastigm

      图  2  海洋青鳉鱼的鳃以及肝的CAT活性

      Figure 2.  CAT activity of gills and liver of O. melastigm

      图  3  海洋青鳉鱼的鳃以及肝的MDA含量

      Figure 3.  MDA activity of gills and liver of O. melastigm

      ROS作为一种含有自由基的活性氧超氧化物,在生物机体内广泛存在。ROS可以破坏机体的抗氧化系统[8]。SOD和CAT酶等共同组成了机体的抗氧化酶系统,是生物体防御氧化应激的第一道防线,可以与机体过量的超氧化物特异性结合,降低机体受损程度[9]。本实验结果显示,米氏凯伦藻会抑制海洋青鳉鱼鱼鳃和肝脏的SOD和CAT活性。已有研究发现,米氏凯伦藻能产生过量的ROS,并降低SOD和CAT酶的活性,从而导致鱼类和贝类的抗氧化系统受到损伤[8, 10-12]。本研究中,高浓度组米氏凯伦藻可以引起海洋青鳉鱼鱼鳃和肝组织内的SOD和CAT的活性显著降低,体内代谢过程产生的ROS无法及时清除,多余的自由基对鱼组织又会降低抗氧化系统的酶活性[8, 10-12]

      生物膜磷脂双分子层是ROS攻击的主要部位,易发生脂质过氧化反应[13]。丙二醛是脂质过氧化反应的产物,如果不及时清除MDA,就会对机体细胞产生毒性作用。MDA的含量可以间接地反映机体脂质的过氧化水平以及ROS对机体的氧化损伤程度[14]。实验进行72 h时,海洋青鳉鱼的鳃组织以及肝脏MDA含量上升,表明有脂质过氧化反应的发生。有研究发现,米氏凯伦藻产生的毒素会引起哺乳动物细胞MDA含量上升,导致细胞脂质过氧化反应的发生[15],即抗氧化系统功能降低,鳃和肝脏组织中SOD、CAT活性降低,机体内活性氧大量积累,进一步加剧了生物膜脂质过氧化反应的发生。根据实验结果,可以推测米氏凯伦藻对海洋青鳉鱼的毒性作用为破坏机体氧化—抗氧化系统的平衡,引起细胞膜脂质发生过氧化反应,从而造成鱼鳃和肝脏的氧化损伤[16]

    • 本文的研究结果表明,高浓度组中海洋青鳉鱼的鳃组织出现鳃丝断裂,成团状,结构不完整,并发生相邻鳃丝的片状融合现象。鳃丝上皮细胞内的细胞核发生偏移,鳃组织整体红肿,局部增大(图4b);低浓度组与对照组中,鳃组织没有出现病变(图4a图4c)。在肝脏组织中,对照组中肝细胞形态正常,并未发生病变(图4g),而高浓度组中肝细胞具有空泡化现象(图4h)。

      图  4  海洋青鳉鱼鳃、肠、肝脏组织切片

      Figure 4.  Tissue sections of gill, intestinal and liver for O. melastigm

      米氏凯伦藻产生的毒素会破坏生物膜的通透性,导致细胞裂解破碎、鳃丝破损、鳃细胞肿胀等现象[3, 5]。藻毒素和其他有毒化合物也会引起鱼类的鳃组织和肝组织产生病理性损伤,如海洋卡盾藻产生的毒素会引起鲈鱼的鳃丝破损;大田软海绵酸毒素会导致海洋青鳉鱼的肝组织出现空泡化现象[17]。米氏凯伦藻产生的脂溶性毒素会导致哺乳动物细胞形态改变,细胞膜破裂,而细胞膜破裂、细胞坏死会进一步使细胞内的活性氧物质积累,从而引发细胞膜过氧化反应的发生,进而脂质过氧化物MDA持续增多[11]

      研究表明,当机体内活性氧物质积累过量时,抗氧化酶活性就会受到影响,如SOD和CAT酶活性降低,细胞膜脂质过氧化反应发生,MDA含量升高,导致细胞膜通透性增大,选择透过性功能降低,细胞内、外液浓度差降低,渗透压降低,细胞膜的结构和功能发生改变,细胞膜破碎,细胞发生坏死[18-19]。因此,本研究中高浓度组的米氏凯伦藻会抑制海洋青鳉鱼的鳃和肝组织SOD和CAT酶活性,体内产生的ROS如果不能及时被清除,就会发生细胞膜脂质过氧化反应,MDA含量升高,细胞膜的通透性发生改变,部分细胞破裂,进而产生病理性损伤。

    • 实验对海洋青鳉鱼肝脏中三个指示性的基因CYP1A1、Il1β以及Hsp70在mRNA水平上的表达情况进行了测定。结果显示,低浓度米氏凯伦藻的添加显著提高了基因CYP1A1和Il1β的表达量(p <0.01, 图5a图5b),也提高了Hsp70基因的表达量(p <0.05,图5c)。

      图  5  海洋青鳉鱼的肝脏基因在mRNA水平上的表达量

      Figure 5.  Expressions of liver genes at the mRNA level in the O. melastigm under control and low dose

      CYP1A1是一种与抗氧化有关的基因,研究发现,外源化合物的刺激可导致海洋青鳉鱼肝组织的CYP1A1基因表达上调,CYP1A1基因的表达在一定程度上降低了机体抗氧化系统的损伤[20]。肝脏组织虽然由于氧化损伤的影响而产生组织病理性损伤,但CYP1A1基因的表达在一定程度上降低了鱼肝脏组织抗氧化系统的损伤。

      此外,已有研究发现,米氏凯伦藻毒素会引起哺乳动物细胞MDA含量上升,导致细胞脂质有过氧化反应的发生[17]。而细胞脂质过氧化反应的发生又可以诱导Il1β的表达上调[21]。机体内过量的过氧化物同样还会诱导Hsp70基因的表达量上调[22]。因此,本实验中Hsp70基因、Il1β基因表达量的显著上升可能是在米氏凯伦藻毒素的胁迫下,打破了机体氧化—抗氧化系统功能的平衡,代谢产生的过量自由基无法被清除,机体内的活性氧不断累积,导致细胞脂质过氧化反应的发生,即MDA含量上升导致Hsp70基因以及Il1β基因表达量的显著上调,引起免疫系统的功能性应激反应。

    • 在高浓度米氏凯伦藻的环境下,海洋青鳉鱼体内的SOD和CAT酶活性在鱼鳃和肝组织中均被抑制,并且随着MDA含量的升高,海洋青鳉鱼还会发生鳃和肝组织脂质过氧化。海洋青鳉鱼肝组织中抗氧化相关基因CYP1A1、Il1β和Hsp70的表达量在低浓度米氏凯伦藻的添加下显著上调,表明有炎症的发生。海洋青鳉鱼组织出现病变的现象:鱼鳃组织受损,部分鳃小片基部融合,肝组织出现空泡化。对功能性组织进行活性氧攻击可能是米氏凯伦藻对鱼类致毒致死作用的重要方式。

参考文献 (22)

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