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氧苯酮（BP-3）作为一种广谱性的紫外线吸收剂、增香剂和阻聚剂，被广泛应用于化学防晒霜、化妆品、洗发水等个人护理用品中[1-3]。据估算，欧盟每年生产大约1000 t BP-3，有3500种防晒霜会添加BP-3[4]。从化学特性上，BP-3具有亲脂性特点，进入环境后很容易被生物吸收并沿食物链传递蓄积。有研究证实，BP-3是一种雌性激素类似物，对生物内分泌系统具有一定的干扰作用，可以引起神经紊乱及发育异常，影响动物胚胎发育等过程[5-8]。BP-3主要通过游客日常的淋浴、冲洗等活动进入地下水和海水系统，全球海洋以及联通的湖泊、河流中几乎无处不在[9]。在夏威夷近岸海域的研究表明，涂抹在皮肤上的防晒霜有25%会在浸泡20 min内被洗掉，每年有4000～6000 t进入周围珊瑚礁水域[10]，并加剧了珊瑚白化和其他海洋生物基因的损伤[11]。因此，夏威夷州已经通过法案从2021年1月起禁止使用含有BP-3的防晒霜[12]。
BP-3对生物的毒性作用已经受到国内外越来越多学者的关注。有研究表明，BP-3可抑制陆生植物的光合作用和呼吸作用，并造成细胞的氧化损伤[13]。对淡水微藻的研究显示，BP-3降低了其光合色素含量[14-15]。但是，BP-3对海洋生物的影响尚不清楚，尤其是针对海洋生态系统初级生产者的大型海藻，目前未见有关BP-3毒性作用的研究报道。光合作用和呼吸作用是植物能量代谢和物质代谢的中心枢纽，为植物细胞提供各种代谢所需要的 ATP和碳骨架。这两条途径中的任意一条受到伤害，都会对植物的生长和代谢造成巨大影响甚至死亡。本研究以野生龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）为受试材料，利用快速叶绿素荧光及光合放氧/呼吸耗氧测定，结合活性氧等生化指标来研究BP-3对龙须菜初级代谢过程的影响，旨在明确BP-3对海生植物的伤害作用及影响机制，为保护海洋环境和维持生态平衡提供科学参考。
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龙须菜于大潮低潮时采集于青岛第二海水浴场，当日用泡沫箱低温（10 ℃左右）运至中国海洋大学实验室。选择表皮完整，大小均一的藻体，在洁净海水浸泡下手工去除表层附着物，用煮沸后冷却至室温的海水冲洗干净。将洗净后的藻株置于装有20 L清洁海水（pH 8.2，盐度32）的水槽中，按F/2培养基补加营养盐，于室温（20 ℃左右）下、光照强度（LED白光射灯）为80 µmol/（m2·s）、光暗周期为14 h∶10 h的条件暂养10 d，暂养期间，持续通入空气。氧苯酮购自Sigma-Aldrich公司（美国）。
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将BP-3溶于酒精并加入清洁海水中，使BP-3终浓度分别为0（对照）、5、10、30 µmol/L。取暂养后的G. lemaneiformis藻段（每段约2.0 g），按5段/L海水的比例置于海水中，分别在无光条件下（黑暗）和80 µmol/（m2·s）光强（光暗周期24 h∶0 h）下室温连续处理30 h。处理过程中，每隔一段时间轻轻晃动容器，保证藻段受光均匀。海水在配置BP-3时，按F/2配方一次性加入营养盐。
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取龙须菜片段，用清洁海水冲洗干净，按照祁峰等[16]的方法，利用黑白瓶法测定海藻的呼吸耗氧速率和净光合放氧速率。设置3个生物学平行，溶解氧浓度用温克勒法滴定，其他条件同处理条件。
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快速叶绿素荧光诱导曲线（OJIP曲线）使用手持式叶绿素荧光仪（FluorPen FP110，捷克）测定。OJIP曲线在K点荧光的相对变化（WK）、J点荧光的相对变化（VJ）及光合电子传递量子产额（φEo）等叶绿素荧光参数按照文献[17]计算。每个处理组重复6次。
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采用南京建成生物工程研究所的试剂盒方法测定。
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黑暗条件下经5～30 µmol/L的BP-3处理后，龙须菜的净光合放氧速率明显下降，且随着BP-3浓度增加，净光合放氧速率降幅增大（图1A）。5 µmol/L、10 µmol/L和30 µmol/L的BP-3处理8 h后，海藻净光合放氧速率分别为对照组的88.7%、83.8%和73.9%，说明BP-3破坏了龙须菜的光合机构。光照条件下，BP-3对龙须菜光合机构的破坏更为严重（图1B）。在80 µmol/（m2·s）光强下，龙须菜经5 µmol/L、10 µmol/L和30 µmol/L 的BP-3处理8 h后，其净光合放氧速率分别仅为对照组的79.8%、65.2%和46.2%。与光合作用不同，龙须菜的呼吸耗氧速率在黑暗条件下不受BP-3影响（图1C），仅在光照条件下明显下降，且随着BP-3浓度的增加，降幅增大（图1D）。5 µmol/L、10 µmol/L和30 µmol/L光下处理8 h后，呼吸耗氧速率降幅分别达12.8%、19.2%和36.5%。以上结果说明，BP-3在黑暗条件下可直接损伤龙须菜的光合作用过程。
图 1 不同浓度氧苯酮对龙须菜净光合放氧速率和呼吸耗氧速率的影响
Figure 1. Effects of different concentrations of oxybenzone on the net photosynthetic O2 evolution rate and respiratory O2 uptake rate in Gracilaria lemaneiformis
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OJIP曲线包含着大量关于光合作用光反应的信息，如PSII供体侧、受体侧活性及光能的吸收、利用效率等，能够灵敏反映植物光合作用的受损位点[17-18]。无论在黑暗还是光照条件下，BP-3处理后的龙须菜OJIP曲线都发生了明显的变化，且随着BP-3浓度的增加，变化幅度增大（图2A、图2B），说明BP-3影响了龙须菜的光反应活性。为了更清晰地展示OJIP曲线的变化幅度，以对照组为0点对BP-3处理组进行标准化分析（图2C、图2D）。可见，与黑暗条件相比，光照条件下BP-3处理引起的OJIP曲线的变化更明显。
图 2 不同浓度氧苯酮对龙须菜快速叶绿素荧光诱导动力学曲线（OJIP曲线）的影响
Figure 2. Effects of different concentrations of oxybenzone on chlorophyll a fluorescence transient (OJIP curve) in Gracilaria lemaneiformis
WK代表光合作用PSII供体侧放氧复合体（OEC）被破坏的程度，WK越高PSII供体侧受损越严重[19]。计算OJIP曲线相关参数发现（图3）：黑暗条件下，不同浓度的BP-3处理均未影响龙须菜的WK（图3A），说明PSII供体侧并非BP-3的直接伤害位点；而光照条件下，BP-3处理后WK升高（图3B），表明OEC的损伤在有光条件下才出现。无论黑暗还是光照条件下，暴露于BP-3的龙须菜VJ均明显上升（图3C、图3D），且随着BP-3浓度的增加上升幅度增大，表明龙须菜光合电子传递链中的还原型质体醌（QA−）积累增加，PSII受体侧相对电子传递能力下降[18,20]。黑暗和光照条件下30 µmol/L浓度BP-3处理8 h后，VJ值分别比对照组升高了43.2%和47.9%。由此认为，BP-3处理可以直接伤害龙须菜PSII受体侧电子载体，造成QA−的大量积累和受体侧过度还原。
图 3 不同浓度氧苯酮对龙须菜叶绿素荧光参数的影响
Figure 3. Effects of different concentrations of oxybenzone on the chlorophyll fluorescence parameters in Gracilaria lemaneiformi
与VJ的变化相反，无论在黑暗还是光照条件下，BP-3处理后龙须菜的φEo均明显下降（图3E、图3F），且随着BP-3浓度的增加下降幅度增大。最大浓度BP-3处理8 h后，黑暗和光照条件下龙须菜的φEo值分别比对照组下降了22.2%和66.7%，表明BP-3直接抑制PSII受体侧后光合电子传递受阻，引起光能吸收与利用的失衡。前人研究显示，BP-3可以破坏黄瓜类囊体膜上PSII受体侧电子载体质体醌（PQs）或细胞色素b6f，限制PSII到PSI的电子传递[9]。本研究通过龙须菜的活体试验，证实了BP-3的抑制位点为PSII受体侧这一结论。
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BP-3暴露8 h后，黑暗条件下龙须菜H2O2及MDA含量并未发生变化（图4），表明龙须菜细胞内未发生氧化损伤。这进一步佐证了基于光合放氧速率的分析结果，即BP-3能够直接破坏龙须菜的光合作用过程，不需要通过氧化胁迫。植物细胞中，光合电子传递和呼吸电子传递是产生活性氧的两个主要代谢过程[21-22]。图1显示，黑暗条件下经BP-3处理的龙须菜，其呼吸作用活性受到轻微影响（图1C），且细胞内H2O2和MDA含量变化不明显，说明BP-3并未通过抑制龙须菜的呼吸作用而诱发活性氧的积累，因此未发生氧化破坏。
图 4 不同浓度氧苯酮处理8 h后对龙须菜H2O2（A）和MDA（B）含量的影响
Figure 4. Effects of 8 h treatment with different concentrations of oxybenzone on the contents of H2O2 (A) and MDA (B) in Gracilaria lemaneiformis
光照条件下，龙须菜的H2O2和MDA含量均明显上升；且随着氧苯酮浓度的增加上升幅度增大，各浓度处理后生物体内H2O2含量分别比对照组升高了19.0%、35.2%和56.1%（图4A）；MDA含量分别比对照组升高了44.7%、57.9%和90.7%（图4B）。PSII反应中心和PSI受体侧是光合电子传递链产生活性氧的主要位点[21]。一旦暴露于光照条件下，光能吸收与利用的失衡必然引起PSII反应中心的过度激发，诱导产生活性氧。光照条件下龙须菜中H2O2和MDA含量上升，表明BP-3除对龙须菜PSII受体侧产生直接破坏外，还引起了氧化胁迫的相伴发生，这将进一步加重对藻细胞的伤害。伤害具体表现为：与黑暗条件相比，光照条件下BP-3处理后龙须菜光合放氧速率下降更明显（图1B），PSII受体侧破坏更严重（图3D），光合电子传递受阻更突出（图3F）；同时，光照条件下BP-3处理后抑制了龙须菜的呼吸作用（图1D），并导致PSII供体侧的破坏（图3B）。
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BP-3可以在暗处直接抑制龙须菜PSII受体侧电子传递，在光照条件下引起光合作用光能吸收与利用的失衡、诱发活性氧的大量产生并诱导PSII供体侧放氧复合体的损伤。氧化胁迫将进一步破坏龙须菜的光合作用和呼吸作用过程，最终破坏整个细胞代谢。
氧苯酮对龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）光合作用和呼吸作用的影响
Effect of oxybenzone on the photosynthesis and respiration of Gracilaria lemaneiformis
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摘要: 本文以野生龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）为受试材料，测定氧苯酮（BP-3）胁迫下龙须菜的快速叶绿素荧光、光合放氧/呼吸耗氧速率及活性氧含量的变化，研究了不同浓度的氧苯酮对龙须菜光合作用和呼吸作用的影响，分析了氧苯酮对水生植物的伤害机理。结果表明，用5～30 µmol/L的BP-3在黑暗条件下处理30 h后，龙须菜的呼吸作用不受影响，但光合作用PSII受体侧电子传递受到明显抑制。在80 µmol/(m2·s)光下，5～30 µmol/L 的BP-3可导致光合作用光能吸收与利用的失衡并诱发活性氧的大量产生，且抑制作用随胁迫浓度升高而加剧。活性氧测定结果进一步显示，光下BP-3诱导的氧化胁迫加剧了龙须菜光合作用PSII受体侧的破坏，并进一步损伤其呼吸作用过程和光合作用PSII供体侧。Abstract: The effect of oxybenzone (BP-3) on the photosynthesis and respiration of wild Gracilaria lemaneiformis was investigated by determining the response of the rapid chlorophyll fluorescence, photosynthetic oxygen evolution rate, respiratory oxygen uptake rate, and active oxygen content in this alga exposed to 0 to 30 µmol/L of this reagent. Results showed that 5~30 mol/L BP-3 had a slight effect on respiration after 30 hours treatment without light, but could directly inhibit the electron transfer of PSII receptor side of photosynthesis in G. lemaneiformis. At 80 μmol/m2/s light, BP-3 caused an imbalance of photosynthetic light energy absorption and utilization, and further induced the over-production of reactive oxygen species. The inhibition was intensified with the increase of BP-3 concentration. The oxidative stress induced by BP-3 would aggravate the damage of PSII receptor side of photosynthesis, and further damage the respiration process and photosynthetic PSII donor side in the seaweed.
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Key words:
- oxybenzone /
- Gracilaria lemaneiformis /
- photosynthesis /
- respiration /
- photosynthetic electron transport
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图 1 不同浓度氧苯酮对龙须菜净光合放氧速率和呼吸耗氧速率的影响
Figure 1. Effects of different concentrations of oxybenzone on the net photosynthetic O2 evolution rate and respiratory O2 uptake rate in Gracilaria lemaneiformis
图 2 不同浓度氧苯酮对龙须菜快速叶绿素荧光诱导动力学曲线（OJIP曲线）的影响
Figure 2. Effects of different concentrations of oxybenzone on chlorophyll a fluorescence transient (OJIP curve) in Gracilaria lemaneiformis
图 3 不同浓度氧苯酮对龙须菜叶绿素荧光参数的影响
Figure 3. Effects of different concentrations of oxybenzone on the chlorophyll fluorescence parameters in Gracilaria lemaneiformi
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