牡蛎隶属软体动物门双壳纲，是广东省重要的海水养殖经济贝类，2019年广东省养殖牡蛎产量达114万吨，位列全国第二^[1]。由于牡蛎的滤食特性，其生长过程容易富集环境中的微生物和藻类，一旦环境受到致病微生物和有毒藻类的污染，极易引发牡蛎病害。近年来，海水养殖贝类中弧菌病暴发流行的事件时有发生^[2]，其主要的病原之一为副溶血性弧菌。副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus）是一种嗜盐性弧菌，普遍存在于海水、沉积物和海产品中，其造成的牡蛎病害不仅使水产养殖业蒙受巨大的经济损失^[3]，还会使食用受污染产品的消费者发生细菌性食物中毒，引发急性胃肠疾病，严重时可导致脱水、休克^[4]。在我国沿海地区，副溶血性弧菌已成为细菌性食物中毒的首位食源性病原菌^[5]。

近年来，广东省的牡蛎养殖产业持续稳定增长，2019年的牡蛎养殖面积比2018年增长了2.28%^[1,6]。随着养殖规模的日益扩增，牡蛎大规模病害暴发的风险也随之增加。为了掌握广东省牡蛎养殖区中副溶血性弧菌的污染状况，降低牡蛎病害暴发及消费者食用牡蛎引发副溶血性弧菌食物中毒的风险，本研究对汕头、汕尾、潮州和惠州等广东沿海地区养殖牡蛎中副溶血性弧菌进行污染调查、毒力基因及耐药性分析，以期为牡蛎养殖过程中副溶血性弧菌的监控、防范致病菌株和耐药菌株的传播提供参考。

1   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   菌株

副溶血性弧菌ATCC17802、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC25922均购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.2   仪器与试剂

Vitek 2 Compact 30全自动微生物鉴定仪（法国BIOMERIEUX公司），T00型PCR仪（美国BIO-RAD公司），DYY-8C 型电泳仪（北京六一仪器公司），3%NaCl碱性蛋白胨水、我妻氏血琼脂平板、3%NaCl胰蛋白胨大豆琼脂（广东环凯微生物科技有限公司），弧菌显色培养基（法国CHROMAGAR公司），革兰氏阴性菌鉴定GN卡、药敏试验AST-GN14卡、AST-GN65卡（法国BIOMERIEUX公司），细菌DNA提取试剂盒（广州艾基生物公司），琼脂糖（美国Sigma公司）。

1.2   方法

1.2.1   样品的采集

2020年4－10月从广东省汕尾市红草镇、汕头市南澳岛、潮州市柘林湾及惠州市考洲洋4个地区的养殖海区共采集牡蛎样品320份，每份样品有10~12只牡蛎，具体采样情况见表1。

表  1  样品信息

Tab.  1  Information of samples

采样时间	采样地点及数量/份				合计/份
	汕尾海区	汕头海区	潮州海区	惠州海区
4－5月	36	30	30	36	132
7－8月	26	18	16	30	90
9－10月	28	22	24	24	98
合计/份	90	70	70	90	320

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1.2.2   副溶血性弧菌的分离和鉴定

牡蛎样品的处理及副溶血性弧菌的分离参照《食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》（GB 4789.7－2013）^[7]进行。分离得到的可疑菌株用Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定仪进行鉴定，以副溶血性弧菌ATCC17802菌株作为阳性对照。

1.2.3   毒力基因tlh、tdh和trh的分析

细菌DNA提取：挑取副溶血性弧菌菌株于3%NaCl胰蛋白胨水培养基36 ℃增菌18 h，将增菌液离心收集菌体，最后采用细菌DNA提取试剂盒提取副溶血性弧菌DNA。

thl、tdh和trh基因扩增：PCR扩增引物由广州艾基生物公司合成，引物序列见表2。PCR反应体系（20 μL）：TaqMIX 10 μL，基因组DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，ddH₂O 7 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s ，循环27次；72 ℃延伸5 min。最后，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

表  2  引物序列

Tab.  2  Sequences of primers

基因	引物序列（5’－3’）	扩增长度/（bp）
tlh	F:AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG	450
	R:GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC
tdh	F:GTAAAGGTCTCTGACTTTTGGAC	270
	R:TGGAATAGAACCTTCATCTTCACC
trh	F:TTGGCTTCGATATTTTCAGTATCT	500
	R:CATAACAAACAATGCCCATTTCCG

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1.2.4   药物敏感性实验

选用Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定仪的药敏模块，采用微量稀释法将筛选出的副溶血性弧菌用AST-GN14及AST-GN65药敏卡进行β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类、硝基呋喃类、氯霉素类、磺胺类7类26种抗生素药敏分析。结果根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）的药物敏感性试验标准判定副溶血性弧菌对抗生素的敏感程度。试验质控菌株为大肠埃希氏菌ATCC25922。

多重耐药（multi-drug resistant，MDR）^[8]为同时对3种或3种以上抗生素耐药。多重耐药指数（multiple antibiotic resistance index，MARI） ^[9] = 菌株耐受抗生素种类数量/受试抗生素种类数量。

1.2.5   数据分析

采用SPSS 22.0软件进行数据分析，以χ²检验方法分析样品中副溶血性弧菌检出率及耐药率的差异，当P<0.05时为差异显著，当P<0.01时为差异非常显著。

2   结果与讨论

2.1   牡蛎中副溶血性弧菌污染状况

320份牡蛎样品中有60份检出副溶血性弧菌，阳性检出率为18.8%（表3）。不同季节采集的牡蛎受副溶血性弧菌污染程度各不相同，秋季的检出率最高，为26.5%，夏季次之，为23.3%，检出率最低的季节是春季，为9.85%。牡蛎中副溶血性弧菌在夏、秋季节的检出率显著高于春季（χ²=12.01，P<0. 01）。

表  3  不同季节牡蛎中副溶血性弧菌的检出情况

Tab.  3  Detection of Vibrio parahaemolyticus in cultured oysters in different seasons

采样时间	样品数/份	阳性样品数/份	检出率/（%）
春季（4－5月）	132	13	9.85
夏季（7－8月）	90	21	23.3
秋季（9－10月）	98	26	26.5
总计	320	60	18.8

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不同海区副溶血性弧菌检出情况见表4，惠州海区的养殖牡蛎中副溶血性弧菌检出率最高（40.0%），汕尾次之（13.3%），潮州和汕头海区的养殖牡蛎中副溶血性弧菌检出率较低，均为8.57%。不同海区养殖牡蛎中副溶血性弧菌的检出率差异有统计学意义，差异非常显著（χ²=37.93，P<0. 01）。

表  4  不同地区养殖牡蛎中副溶血性弧菌检出情况

Tab.  4  Detection of Vibrio parahaemolyticus in cultured oysters in different regions

采样地点	样品数/份	阳性样品数/份	检出率/（%）
汕尾海区	90	12	13.3
汕头海区	70	6	8.57
潮州海区	70	6	8.57
惠州海区	90	36	40.0

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已有的研究结果表明，温度是影响副溶血性弧菌生长的关键因素^[10]，温度越高，其检出率也随之升高，本研究中温度高的夏、秋季副溶血性弧菌检出率最高，也验证了这一点。此外，本文研究的养殖牡蛎均来自海区产地养殖环节，与许多的研究报道相比，养殖环节的检出率明显低于销售环节。例如，销售环节中副溶血性弧菌的检出率：连云港为61.2%^[11]，厦门和福州检出率高于50%^[12]，青岛检出率为42.3%^[13]，均明显高于养殖环节中副溶血性弧菌的检出率（浙江沿岸为22.5%^[14]、广东阳江为22.01%^[15]，本研究为18.8%），这与张铮等^[16]的研究结果相符，分析其原因可能是牡蛎在运输、储存和销售等环节中存在副溶血性弧菌交叉污染。因此，牡蛎在流通和销售过程中保持低温能够有效延缓副溶血性弧菌的生长，从而降低污染程度。

2.2   牡蛎中副溶血性弧菌的毒力基因分析

从阳性样品中分离得到60株副溶血性弧菌，对其进行tlh、tdh和trh基因分析。PCR扩增和电泳检测结果显示，所有分离株均检测出tlh基因，而tdh基因和trh基因均未检出。部分菌株电泳结果如图1所示。

图  1  部分副溶血性弧菌分离株的毒力基因PCR电泳

注：M：DL2000 Marker；1～3：副溶血性弧菌标准菌株；4：阴性对照；5～8：部分副溶血性弧菌分离株

Fig.  1  PCR amplification of virulent genes in Vibrio parahaemolyticus isolates

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流行病学研究表明，溶血素是导致副溶血性弧菌致病的主要因素 ^[17]。副溶血性弧菌产生的溶血素有不耐热溶血素（TLH）、耐热直接溶血素（TDH）和耐热直接相关溶血素（TRH）， 分别由tlh、tdh和trh基因编辑^[18]。本研究从养殖牡蛎分离得到的副溶血性弧菌均检出了其特有的保守基因——tlh基因，该基因无论在临床还是环境中的分离株均能被检出^[19]。通常认为具有溶血活性的TDH和TRH是副溶血性弧菌的主要致病因子，其与食源性疾病暴发密切相关^[17-19]。本研究全部分离株均未检出tdh和trh基因，表明从养殖牡蛎中分离得到的副溶血性弧菌的致病风险较低。

2.3   牡蛎中副溶血性弧菌的药物敏感性分析

2.3.1   整体耐药情况

对60株副溶血性弧菌进行26种抗生素的耐药试验，结果见表5。可以看出，分离株对9种抗生素产生了不同程度的耐药，大多数菌株对氨苄西林耐药，耐药率为83.3%；少部分菌株对哌拉西林、四环素、呋喃妥因、头孢氨苄、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素、复方新诺明等8种抗生素耐药，耐药率分别为11.7%、10.0%、8.33%、3.33%、3.33%、3.33%、1.67%和1.67%；全部菌株对头孢泊肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、厄他培南、美罗培南、阿米卡星、妥布霉素、马波沙星和氯霉素12种抗生素敏感；66.7%的分离株对头孢唑林中介敏感，少量分离株对阿莫西林、头孢维星、头孢噻呋和恩诺沙星中介敏感。

表  5  副溶血性弧菌药敏试验结果

Tab.  5  Antimicrobial resistance of Vibrio parahaemolyticus isolates

抗生素种类		抗生素及缩写	菌株数			敏感率/ （%）	中介敏感率/（%）	耐药率/（%）
			S	I	R
β-内酰胺类	青霉素类	氨苄西林 AMP	6	4	50	10	6.67	83.3
		阿莫西林 AMC	58	2	0	96.7	3.33	0
		哌拉西林 PIP	43	10	7	71.7	16.7	11.7
	头孢菌素类	头孢氨苄 CN	58	0	2	96.7	0	3.33
		头孢泊肟 CPD	60	0	0	100	0	0
		头孢维星 CFO	54	6	0	90.0	10.0	0
		头孢噻呋 CFT	58	2	0	96.7	3.33	0
		头孢唑林 CZ	20	40	0	33.3	66.7	0
		头孢他啶 CAZ	60	0	0	100	0	0
		头孢曲松 CRO	60	0	0	100	0	0
		头孢吡肟 FEP	60	0	0	100	0	0
		氨曲南 ATM	60	0	0	100	0	0
	碳青霉烯类	亚胺培南 IPM	60	0	0	100	0	0
		厄他培南 ETP	60	0	0	100	0	0
		美罗培南 MEM	60	0	0	100	0	0
氨基糖苷类		阿米卡星 AN	60	0	0	100	0	0
		庆大霉素 GM	59	0	1	98.3	0	1.67
		妥布霉素 TM	60	0	0	100	0	0
喹诺酮类		恩诺沙星 CNR	58	2	0	96.7	3.33	0
		马波沙星 MRB	60	0	0	100	0	0
		环丙沙星 CIP	58	0	2	96.7	0	3.33
		左氧氟沙星 LEV	58	0	2	96.7	0	3.33
四环素类		四环素 TE	54	0	6	90.0	0	10.0
硝基呋喃类		呋喃妥因 FT	55	0	5	91.7	0	8.33
氯霉素类		氯霉素 C	60	0	0	100	0	0
磺胺类		复方新诺明 SXT	59	0	1	98.3	0	1.67
注：R是耐药；I是中介敏感；S是敏感

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药敏结果发现，分离株对氨苄西林普遍耐药，与国内外报道的氨苄西林耐药情况相似^[20-23]；分离株耐药和中介敏感的药物集中在早期使用的抗生素如青霉素类（氨苄西林和哌拉西林）和第一代头孢（头孢唑林），而对新型或使用时间较短的药物则呈现高敏感率，如菌株对第三、四代头孢（头孢泊肟、头孢曲松和头孢吡肟）和碳青霉烯类的敏感率为100%。这一结果表明，这些应用时间较长的抗生素，其耐药基因可能已在环境中普遍存在。值得注意的是，水产养殖禁用药物^[24]左氧氟沙星和呋喃妥因在本次研究中出现了耐药菌株，表明养殖环境中可能存在这两种禁用药物。

60株分离株共有8种耐药谱（表6），分离株的整体耐药率为90.0%（54/60），仅有6株菌对所有测试的抗生素没有产生耐药。同时耐受2种以上抗生素的菌株占23.3%（14/60），分离株的多重耐药率为3.33%（2/60），其中1株菌耐受3种抗生素，另外1株菌耐受7种抗生素。分离株的MARI范围为0.04～0.27，目前国内外已有不少学者^[25-26]使用MARI评价副溶血性弧菌耐药程度，评价认为当MARI >0.2，即表明产品受到了较高程度的抗生素药物污染和对人类健康有较大的威胁。虽然本研究调查的分离株多重耐药率不高，但出现了MARI >0.2的菌株，说明个别牡蛎样品受到了较为严重的抗生素污染。

表  6  副溶血性弧菌耐药谱

Tab.  6  Resistant resistance spectrum of Vibrio parahaemolyticus isolates

耐药谱	菌株数	百分比/（%）	MARI
AMP	40	71.7	0.04
AMP-PIP	6	10.0	0.08
AMP-GM	1	1.67	0.08
AMP-FT	1	1.67	0.08
AMP-TE	1	1.67	0.08
TE-FT	3	6.67	0.08
CN-TE-FT	1	1.67	0.12
AMP-PIP-CN-TE-SXT-CIP-LEV	1	1.67	0.27

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2.3.2   不同海区养殖牡蛎中副溶血性弧菌耐药情况

60株分离株中来自惠州、汕尾、汕头和潮州海区的分离株数分别是 38株、10株、5株和7株，其耐药率依次是97.4%、80%、80%和71.4%。从4个海区分离株的药敏结果（图2）可见，分离株对氨苄西林均有较高的耐药率（71.4%～86.8%），耐药率的差异不显著（χ²=1.171，P>0.05）。从耐受的抗生素种类来看，来源于惠州海区的菌株耐受的抗生素种类多达9种，来源于潮州、汕头和汕尾海区的分离株耐受的抗生素种类均为2种。在研究调查的4个地区中，惠州位于珠三角核心区，与地处沿海经济带东翼地区的汕头、汕尾和潮州地区相比，不仅人口密度高^[27]，人类经济活动也相对频繁。本次研究发现，副溶血性弧菌污染率最高的惠州海区，其分离株的耐药情况亦最为复杂，不仅耐药种类数量多，而且出现的2株多重耐药菌株均来自该海区。原因可能是副溶血性弧菌的污染程度越高其分离株的数量则越多，耐受药物的概率也就越大。同时推测，惠州地区养殖环境受到的抗生素污染程度较高， 其原因可能与人类活动影响有关。

图  2  不同地区牡蛎样品中副溶血性弧菌药敏试验结果

Fig.  2  Antimicrobial resistance of Vibrio parahaemolyticus isolates in cultured oysters in different regions

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分析比较其他不同地区养殖贝类中副溶血性弧菌的耐药情况，山东和辽宁沿海地区养殖海水贝类中副溶血性弧菌对3种抗生素耐药，大部分菌株对氨苄西林耐药（91.7%），没有出现多重耐药菌^[21]；黄渤海区养殖贝类中副溶血性弧菌的整体耐药率高达96.36%，35.76%的菌株出现多重耐药，部分菌株受到抗菌药物污染程度较严重^[22]；福建和广西海区养殖牡蛎分离株总耐药率为73.68%，耐药单一，即对氨苄西林的耐药率最高^[23]。结合本研究的结果发现，各海区养殖贝类中副溶血性弧菌分离株除对氨苄西林普遍耐药外，对其他抗生素耐药的种类和程度各有不同，其原因可能是各地区不同的养殖环境及养殖模式下抗生素污染水平不同。分离株的耐药情况与同为广东沿海地区的阳江养殖牡蛎耐药情况^[28]相比，阳江地区养殖牡蛎及其养殖环境中细菌的耐药情况比较严重，30%以上的菌株出现多重耐药。本次研究的分离株中多重耐药率（3.33%）较低，表明本文中4个海区养殖牡蛎受抗生素污染程度较阳江地区轻。

值得注意的是，本文研究调查的牡蛎来自开放的近岸海水筏式吊养，养殖过程中通常不会使用抗生素，然而分离出的副溶血性弧菌却出现了不同程度的耐药性，表明其所在的养殖环境受到抗生素污染或环境中存在抗生素抗性基因（ARGs）。在海水养殖业的快速发展下，水体及沉积物中抗生素污染问题日益严峻，我国海水养殖环境普遍受到了ng/L～µg/L水平的抗生素污染^[29]。海水养殖环境中的细菌耐药状况亦不容乐观，写腊月等^[30]研究发现，来自海水养殖环境中的受试弧菌至少对1种抗生素耐药，交叉耐药和多重耐药现象比较普遍。令人担忧的是，不少研究发现ARGs普遍存在于海水养殖环境中^[31]，耐药细菌和ARGs一旦扩散迁移进入海水养殖生物中，便可通过食物链进入人体，从而威胁人类健康。

3   结 论

（1）2020年广东沿海养殖牡蛎的副溶血性弧菌污染程度呈地区及季节性差异，温度高的夏、秋季是副溶血性弧菌检出的高峰期。研究分离得到的60株副溶血性弧菌均未携带毒力基因tdh和trh，其致病风险较低，但部分菌株的耐药程度较严重，其携带的ARGs对人类健康具有潜在的威胁。

（2）在研究调查的地区中，惠州海区养殖牡蛎受副溶血性弧菌污染程度最高，耐药情况亦最复杂。