主要试剂和化学品包括16种优控PAHs标准物混合溶液（Pestek公司）、六甲基苯（Aldrich公司）、正己烷（色谱纯，Anpel公司）、丙酮（色谱纯，Anpel公司）、二氯甲烷（色谱纯，Anpel公司）、甲醇（色谱纯，Anpel公司）、中性氧化铝（Merck公司，马弗炉450 ℃灼烧12 h）、中性硅胶（Merck公司，马弗炉450 ℃灼烧12 h，按硅胶和纯水97∶3的重量比加入纯水对中性硅胶进行活化）、无水硫酸钠（Anpel公司，马弗炉450 ℃灼烧12 h）。

本研究于2019年6月在南沙群岛的南薰礁海域采集了3个长棘海星样品（直径为19～21 cm，湿重为168～217 g），于2020年8月、2021年3月在西沙群岛的浪花礁、华光礁以及盘石屿海域采集了15个（直径为8～30 cm，湿重为41.3～458 g）和6个（直径为9.5～24 cm，湿重为22.3～584 g）长棘海星样品，于2021年8月在西沙群岛采集了2个海水样品（体积分别为40 L和90 L）。长棘海星样品由潜水员使用人工水肺潜水采集。海水样品采集表层水样，使用玻璃纤维滤膜（Whatman，GF/F，0.7 μm）过滤颗粒物后，以1 L/min的流速使滤液通过已抽提净化的聚氨酯泡沫（PUF）进行溶解态PAHs的现场富集^[9]。长棘海星与PUF样品冷冻保存运输至实验室待分析。

长棘海星按照主要器官解剖为幽门盲囊、胃和表皮3个部分，其中部分样品由于低于分析质量条件没有对其进行PAHs的萃取。将长棘海星3种组织和PUF样品进行冷冻干燥，其中生物样品研磨成粉后用铝箔包裹。预处理后的长棘海星组织与PUF样品干燥密封，低温保存，以待PAHs的萃取。

采用Han等人^[12]的方法，准确称取长棘海星组织干样品约1 g（精确到0.0001 g），并用经甲醇和二氯甲烷净化后的滤纸包裹后放入索氏抽提管中待抽提。取120 mL正己烷/丙酮混合溶剂（V∶V=1∶1）于150 mL圆底烧瓶中，加入80 ng回收率指示剂（萘-D8、苊-D10、菲-D10、䓛-D12、苝-D12），在恒温水浴下索氏抽提48 h。抽提液使用旋转蒸发仪浓缩至1 mL左右后，加入正己烷约3 mL继续浓缩，重复3次。浓缩后的抽提液转移至已经称重的4 mL棕色瓶中，使用正己烷清洗残余的抽提液并一同转移至4 mL棕色瓶，最终体积约为4 mL，称量含有抽提液的瓶重。使用移液枪准确移取0.5 mL抽提液至细胞瓶中，并称量转移出去的抽提液重量，以确定其占总抽提液的百分比。用烘箱在80 ℃下干燥转移出来的抽提液。干燥后残余的物质则视为粗脂肪，以重量法测定粗脂肪含量。剩余的抽提液使用温和的氮气吹扫浓缩至约1 mL后，移入先后使用6 mL二氯甲烷/正己烷混合溶液（V∶V=8∶2）和6 mL正己烷活化后的ENVI^TM-Florisil（500 mg，3 mL）固相萃取小柱中进行净化与分离。使用15 mL二氯甲烷/正己烷混合溶液（V∶V=8∶2）洗脱ENVI^TM-Florisil柱以分离出PAHs组分。将洗脱液使用温和的氮气吹扫浓缩至约1 mL后，使用从上到下依次装有1 cm无水硫酸钠、3 cm中性硅胶和3 cm中性氧化铝的玻璃层析柱（内径8 mm，长度15 cm）对洗脱液进行深层净化。使用15 mL正己烷/二氯甲烷混合溶液（V∶V=1∶1）洗脱层析柱。将洗脱液装于15 mL棕色瓶中，并使用温和的氮气吹扫浓缩洗脱液至刚刚盖住瓶底。转移洗脱液至2.0 mL进样瓶，并用约1.5 mL正己烷清洗残留洗脱液后一同转移至进样瓶，继续使用温和的氮气吹扫浓缩洗脱液至体积约0.5 mL，加入100 ng六甲基苯作为内标，待仪器分析。

采用Han等人^[11]的方法，将冷冻干燥后的PUF样品放入索氏抽提管中，取120 mL二氯甲烷于150 mL圆底烧瓶中，加入80 ng回收率指示剂（同生物样品），在恒温水浴条件下索氏抽提48 h。抽提液使用旋转蒸发仪浓缩至1 mL左右后，加入正己烷约3 mL继续浓缩，重复3次。浓缩后的抽提液转移至4 mL棕色瓶中，使用正己烷清洗残余的抽提液并一同转移至4 mL棕色瓶中，最终体积约为4 mL。抽提液使用温和的氮气吹扫浓缩至1 mL左右，后续分析方法与生物样品处理方法一致。

使用安捷伦7890B气相色谱串联7000C三重四极杆质谱仪（GC-MS/MS）对16种优控PAHs进行定量分析^[11]。色谱柱为安捷伦公司生产的HP-5MS低流失石英弹性毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）。具体分析条件可参见本课题组已经发表的论文^[11]。

整个实验流程严格使用实验室流程空白、野外空白、回收率指示剂、平行样和分析仪器检出限进行质量控制。5种氘系回收率指示剂的回收率分别为萘-D8（68±16）%；苊-D10（80±20）%；菲-D10（91±32）%；䓛-D12（83±29）%；苝-D12（93±30）%。其中由于萘（Nap）易挥发，回收率相对较低，后续结果分析时不包含在内，因此以∑₁₅PAHs表示长棘海星体内15种PAHs的总含量水平。空白样品中的目标化合物均未检出或低于仪器检测限（IDLs），PAHs含量均没有使用回收率进行校正，平行样的标准偏差均在10%以内。以3倍的最低标准信噪比（S/N）计算IDLs，以3倍的IDLs计算方法检出限（MDLs），得出海水和生物样品的MDLs分别为0.79～20.6 pg/L和0.03～0.09 ng/g dw。

如表1所示，长棘海星3种组织和海水中均检测出PAHs化合物。长棘海星组织中有一半以上化合物检出率高于70%，3～5环PAHs的检出率为94%～100%，6环PAHs在长棘海星组织中检出率较低，均不高于35%。与南海珊瑚组织[（70.5±109）ng/g dw]相比^[11]，南海长棘海星胃中的∑₁₅PAHs含量[（107±96.9）ng/g dw]处于较高水平，可能反映了长棘海星对PAHs的生物放大效应。海水中15种PAHs的检出率均为100%。本次调查的西沙海水中∑₁₅PAHs浓度[（254±18.7）ng/L]较2015年6月[（57.3±9.60）ng/L]^[11]明显增高，且海水中全部检出5环和6环PAHs，表明南海受PAHs污染可能呈加重趋势。

南海长棘海星3种组织和海水中PAHs均以3环PAHs为主（图1）。南海长棘海星3种组织中3环PAHs的占比（69%～85%）与南海珊瑚组织中的相应占比（77%）^[11]相当，这与长棘海星以珊瑚为主要食物这一事实相符。长棘海星3种组织中5～6环PAHs占比（3%～11%）高于海水中的相应占比（1%），这应该是因为5～6环PAHs相对3～4环PAHs具有更强的脂溶性，易于被生物吸收而在体内蓄积^[13]。

图  1  南海长棘海星组织和海水中PAHs的组成特征

Figure 1.  Composition characteristics of PAHs in Acanthaster planci tissues and seawater from the South China Sea

经统计分析，不同区域和不同季节长棘海星组织中∑₁₅PAHs含量均无明显差异，故下文将它们看作一个整体进行讨论。如图2所示，南海长棘海星不同组织中∑₁₅PAHs含量存在显著差异，其中胃中∑₁₅PAHs含量[（107±96.9）ng/g dw]显著大于幽门盲囊[（29.0±34.5）ng/g dw]和表皮[（31.0±23.5）ng/g dw]（p<0.01）。不同环数的PAHs在不同组织中的含量也均有差异，这种组织间的差异可能与组织生理功能和吸收能力有关。长棘海星主要以珊瑚为食，它们在捕食珊瑚时，会翻出贲门胃包住珊瑚，同时会分泌消化酶^[5]。长棘海星的消化主要发生在幽门胃，而幽门盲囊主要负责吸收和贮存营养物质。因此，推测长棘海星在幽门胃中消化珊瑚时会同步吸收较多PAHs于胃中，特别是珊瑚黏液可吸收或吸附较多的PAHs^[11]，导致胃中∑₁₅PAHs含量显著高于幽门盲囊和表皮。另外，根据柯可^[14]的研究，贝类脂肪含量较多的消化腺可导致脂溶性PAHs的累积，因此，长棘海星胃中高含量的PAHs还可能与胃中含脂量较多有关。

图  2  南海长棘海星不同组织中PAHs含量水平

Figure 2.  Concentrations of PAHs in Acanthaster planci tissues from the South China Sea

为了解不同生长阶段长棘海星组织中∑₁₅PAHs含量的变化规律，对长棘海星整体和3种组织中∑₁₅PAHs 含量与辐径进行相关性分析。其中长棘海星整体、胃和表皮中∑₁₅PAHs 含量与辐径符合正态分布，使用皮尔逊相关性检验；长棘海星幽门盲囊中∑₁₅PAHs含量不符合正态分布，则使用非参数秩（斯皮尔曼）相关性检验。结果表明，长棘海星体内∑₁₅PAHs含量与辐径呈显著的负相关关系（p<0.05），其中在幽门盲囊中呈极显著负相关关系（p<0.01）（图3），在胃和表皮中相关性不显著。上述结果说明，幼年长棘海星对PAHs的积累能力强于成年长棘海星，并且在幽门盲囊中尤为明显。这可能是因为幼年长棘海星在生长发育旺盛时期捕食珊瑚频繁，对PAHs积累能力较强，而成年长棘海星生长缓慢，对PAHs的积累能力较弱。同时，幼年和成年长棘海星对于PAHs代谢能力的差异也可能影响其呈现出的积累能力。

图  3  南海长棘海星整体（A）和幽门盲囊（B）中∑₁₅PAHs含量与长棘海星辐径的关系

Figure 3.  The relationship between ∑₁₅PAHs and diameter in whole(A) and pyloric caecum(B) of Acanthaster planci from the South China Sea

海洋生物主要通过表皮被动吸收、主动摄食等方式富集PAHs^[2]。本文通过计算生物富集因子（BAFs）来反映南海长棘海星组织中PAHs的生物富集特征。文中BAFs（单位：L/kg）被定义为长棘海星组织中PAHs的湿重含量（单位：ng/kg ww）与溶解在周围海水中的PAHs浓度（单位：ng/L）的比值。由于南沙海域没有采集海水样品，本文仅计算和讨论西沙长棘海星的BAFs。如果样品中没有检测出PAHs，则在BAFs计算中用MDLs代替。

如图4所示，长棘海星幽门盲囊、胃和表皮中PAHs的lg BAFs范围分别为−0.97～4.70，−0.49～4.89和−0.39～4.59，表明长棘海星组织对不同PAHs的富集能力存在明显差异。3～4环PAHs在所有长棘海星组织中富集能力较弱（即BAFs<2000 L/kg或lg BAFs<3.3）^[15]，5～6环PAHs（除BkF）在大部分长棘海星组织中富集能力也较弱，但BkF在所有幽门盲囊和表皮以及大部分胃组织中均呈现较强的生物富集能力（即BAFs>5000 L/kg或lg BAFs>3.7）^[15]，说明长棘海星组织中BkF呈现出明显富集现象，可能存在潜在风险。5～6环PAHs的平均lg BAFs均高于3～4环PAHs的平均lg BAFs，这是因为5～6环PAHs有较强的脂溶性，更易于被生物吸收。此外，高分子量（4～6环）PAHs可以在环境中长时间存在且遗传毒性较强。例如，CHR、BaA、BbF、BkF、BaP、Ind、DiB和BghiP是国际公认的致癌、致畸和致突变污染物^[16]。海洋生物体内积累较多的高分子量PAHs，不仅会引起生物损伤的累积，而且最终可以通过食物链传递或死亡分解进一步威胁到生态系统中其他海洋生物的生存安全。

图  4  南海长棘海星不同组织中PAHs的lg BAFs

Figure 4.  The lg BAFs of PAHs in different tissues of Acanthaster planci from the South China Sea

高分子量PAHs/低分子量PAHs（HMW/LMW）、BaA/（BaA+CHR）和FLUA/（FLUA+PYR）比值法常被用来解析PAHs的来源^{[12, 17]}。如图5所示，长棘海星体内PAHs为燃烧源以及石油和成岩混合源，这可能与周边国家燃烧活动和南海海域频繁的船只航行有关。中南半岛多为发展中国家，化石燃料和煤炭的使用较为频繁，此外，独特的地形和气候条件以及大规模农林开发使其成为生物质燃烧频发的一个区域^[18]。

图  5  南海长棘海星中PAHs特征化合物比值

Figure 5.  The ratios of PAHs characteristic compounds in Acanthaster planci

主成分分析与多元线性回归法（PCA-MLR）可以利用线性变换从众多变量中提取出几个具有代表性的因子来实现降维分析，之后再进行多元线性回归来计算不同污染源对样品的贡献率，其经常被用于PAHs来源的定量分析^[9]。

主成分分析提取的3个公因子（F1—F3）解释了总方差的90%，旋转后各指标变量对各因子的载荷如图6所示。结果显示，F1对BaA、BbF、BkF、BaP、Ind、DiB和BghiP有较强的载荷（因子载荷值>0.75），指示为汽油、柴油和天然气的燃烧^[19]；F2对ANTH、PHE、PYR、FLUA和FLU有较强载荷，指示为煤炭的燃烧和炼焦源^[19]；F3对ACEY和ACE有较强载荷，指示为木材、生物质燃烧以及石油或成岩源^[20-21]。

图  6  旋转因子载荷矩阵

Figure 6.  Rotation factor loading matrix

将主成分分析产生的得分因子作为自变量，∑₁₅PAHs作为因变量进行多元线性回归分析。结果显示，柴油、汽油和天然气燃烧共同贡献了19%的PAHs，煤炭燃烧和炼焦源共同贡献了67%的PAHs，木材、生物质燃烧以及石油或成岩源则共同贡献了14%的PAHs。因此，南海长棘海星体内PAHs主要来源于化石燃料和生物质等燃烧源，少部分来源于石油或成岩源。这些PAHs的混合来源可能来自南海周边国家的燃煤发电厂、各种交通工具的尾气排放、天然气的广泛使用和南海海域航行的各种船舶石油泄漏等。前人的研究也发现南海珊瑚礁区鱼类体内PAHs的来源多样，以燃烧和溢油混合源为主，与本研究结果一致^[10]。

（1）南海珊瑚礁区长棘海星中均检出了PAHs，且长棘海星不同组织中PAHs总含量差异明显，胃组织中的含量显著大于幽门盲囊和表皮。

（2）长棘海星体内PAHs总含量与辐径呈显著负相关关系，相比成年长棘海星，长棘海星幼体对PAHs的积累能力更强。

（3）长棘海星对大部分PAHs的BAFs小于2000 L/kg，富集能力较弱，但对BkF的BAFs普遍大于5000 L/kg，富集能力较强。

（4）南海长棘海星体内PAHs来源复杂，大部分为化石燃料和生物质等燃烧源，少部分来源于石油或成岩源。