生物表面活性剂是微生物在一定条件下产生的一种非均质代谢产物，与传统的化学合成表面活性剂相比，生物表面活性剂具有许多显著优势，如生物降解性高、毒性低、环境友好等 ^[1-3]。因此，生物表面活性剂在制药、食品工业^[4]、精细化工和原油回收^[5]等领域具有广泛的应用，特别是在海洋污染物的生物处理方面具有巨大潜力，可以促进原油污染海洋环境的生态恢复^[6]。

虽然很多微生物菌株可以产生多种结构各异、性能优良的生物表面活性剂，但是由于传统微生物菌株的生物表面活性剂合成代谢慢，导致生产成本较高，限制了生物表面活性剂的广泛应用^[7]。此外，常见生物表面活性剂的合成仍然局限于少数几种微生物，分离新的产生菌有助于拓宽生物表面活性剂产生菌的菌种库。因此，分离出生长代谢快、培养周期短的新型微生物菌种逐渐成为生物表面活性剂领域的研究热点，进一步优化培养条件可为后续发酵生产奠定基础，有利于生物表面活性剂的工业应用。本文从海水中分离到一株产生物表面活性剂的微生物菌株S-22，通过摇瓶实验初步确定了该菌株最佳培养条件，分析了产生的生物表面活性剂的结构和主要理化性质。

1   材料与方法

1.1   微生物、培养基及培养条件优化

从青岛港8号码头附近海域分离得到一株生物表面活性剂产生菌株S-22。采用形态观察并结合Biomerieux微生物自动鉴定仪进行菌种鉴定。

液体培养基由葡萄糖（30.0 g/L）、磷酸二氢钾（3.0 g/L）、磷酸氢二钾（4.0 g/L）、硫酸铵（2.0 g/L）、氯化钠（1.0 g/L）、氯化钾（1.0 g/L）、七水合硫酸镁（0.1 g/L）、无水氯化钙(0.02 g/L)、EDTA钠盐（0.01 g/L）、七水合硫酸亚铁（0.002 g/L）、七水合硫酸亚锌（0.0025 g/L）和一水合硫酸锰（0.002 g/L）组成，pH为7.0～7.5，在0.56 kg/cm²压力下灭菌30 min。

菌株S-22在30 ℃下200 r/min培养12 h制备种子培养液，而后转移2 mL种子培养液至新鲜培养基扩大培养。分别以葡萄糖、蔗糖、淀粉、花生油、正十六烷、石蜡和原油为碳源，在30 ℃下200 r/min培养72 h，分析碳源对菌株S-22发酵代谢的影响。分别以硝酸铵、硝酸钠、氯化铵、硫酸铵和尿素为氮源，在30 ℃下200 r/min培养48 h，分析氮源对菌株S-22发酵代谢的影响。此外，分析初始pH（4.0～9.0）和培养温度（25 ℃～45 ℃）对菌株S-22发酵代谢的影响。

使用紫外可见分光光度计（Varian Cary 50型，美国）测量培养液620 nm处的光密度用来表征生物量（记作OD_{620 nm}），通过8000 g离心去除菌体细胞后，使用表面张力测定仪（ST-2型，美国）测定培养液表面张力，使用笔式酸度计测定pH^[8]。

1.2   生物表面活性剂的提取和纯化

培养液在10 ℃下8000 g离心去除菌体细胞，得到无细胞提取液，用2 mol/L的盐酸溶液调整pH至2.0。采用正己烷-二氯甲烷（体积比1∶1）、醚、氯仿、二氯甲烷、丁酸乙酯、正庚烷、氯仿-甲醇（体积比2∶1）和乙酸乙酯等有机溶剂与之等量混合30 min，通过分液漏斗分离后收集有机相，水相经二次提取并入有机相，经无水Na₂SO₄脱水、45 ℃减压真空浓缩得到生物表面活性剂粗产物。

采用柱层析法对生物表面活性剂粗产物进行纯化。将2.0 g粗产物溶于10 mL氯仿中，转移入装填50 g活性硅胶的色谱柱中，首先采用正己烷-二氯甲烷（体积比1∶1）洗脱，然后用氯仿-甲醇（5∶1～1∶5）梯度洗脱，经45 ℃减压真空浓缩得到生物表面活性剂纯化产物。

1.3   生物表面活性剂组成分析

1.3.1   薄层层析分析

用毛细玻璃管将生物表面活性剂样品点样于20 cm×20 cm层析硅胶板上（青岛海洋化工）进行薄层层析（thin layer chromatography, TLC）分析。采用氯仿-甲醇-水（体积比85∶15∶2）为糖脂的展开溶剂，苯酚-硫酸显色；采用氯仿-甲醇-水（体积比65∶25∶4）为磷脂的展开溶剂，钼酸铵-高氯酸显色；采用氯仿-甲醇-氨（体积比65∶35∶5）为脂肽的展开溶剂，水合三酮氢茚显色；采用正己烷-氯仿-乙酸（体积比20∶80∶0.5）为脂肪酸的展开溶剂，2,7-二氯荧光素-三氯化铝-三氯化铁显色。

1.3.2   傅立叶变换红外光谱分析

采用KBr压片法对生物表面活性剂样品进行傅立叶变换红外光谱（fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR）分析。

1.3.3   组成结构分析

将0.2 g样品溶解于1 mol/L氢氧化钠-甲醇溶剂混合物的醚溶剂中，在70 ℃反应1 h。加入盐酸溶液将pH调至2.0，用醚萃取脂肪酸物质，分别收集有机相和水相。

有机相经无水Na₂SO₄脱水后，与甲醇-硫酸反应，得到的甲酯化产物进行GC-MS分析^[9]。仪器为Agilent GC6890-MS5973N，采用HP-5MS熔融石英毛细管柱，膜厚为0.25 µm，毛细管柱规格为30 m×0.32 mm×0.25 μm。进样体积：1 μL；载气流量：1 mL/min，温度程序在50 ℃保持1 min，然后以15 ℃ /min的速度从50 ℃上升到320 ℃，在320 ℃保持2 min；检测器温度：250 ℃；电离模式：EI（70 ev）；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；获取方式：扫描、全扫描，m/z范围为30～450 amu；溶剂延迟：3 min。以酯化十六烷酸为外标，NIST98谱库鉴定。

水相经离子交换柱（Dowex50型，天津化学试剂厂）过滤脱盐，减压真空浓缩后进行薄层层析分析。展开溶剂为正丁醇-乙醇-水（体积比40∶10∶20），显色剂为α-萘酚。标准糖包括海藻糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、焦耳糖、蔗糖和鼠李糖（上海第二化学试剂厂）。

1.4   生物表面活性剂特性分析

1.4.1   临界胶束浓度

采用逐级稀释法测定生物表面活性剂的临界胶束浓度（critical micelle concentration, CMC）^[10]。配制生物表面活性剂溶液，逐级稀释，并测定一系列不同浓度生物表面活性剂溶液的表面张力，作浓度回归曲线，将曲线转折点两侧的直线部分外延，相交点的浓度即此体系中表面活性剂的CMC。

1.4.2   乳化能力

取5 mL生物表面活性剂溶液，加入44.5 mL pH=7.20的Tris-HCl缓冲液和0.5 mL正十六烷，超声振荡20 s，之后室温静置20 min。以Tris-HCl缓冲液作为对照，用紫外可见分光光度计（Varian Cary 50型，美国）测定乳化相的OD_{620 nm}。

1.4.3   耐高温和耐盐能力

取10 mL生物表面活性剂溶液稀释至CMC，在100 ℃分别保持0.5～4 h，冷却至30 ℃后测量其表面张力，分析其耐高温能力。在0～100 g/L浓度的NaCl作用下室温保持4 h，测量其表面张力，分析其耐盐能力。

2   结果与讨论

2.1   菌株S-22的鉴定

菌株S-22在营养琼脂上培养时，菌落呈半透明、黄色、圆形、边缘整齐、润湿。经显微镜观察发现，该菌株生长过程中有明显的杆状和球状形态周期变化。16 h菌体细胞呈杆状、（0.8～1.2） µm×（2.5～3.0 ）µm、端圆；而48 h菌体细胞几乎全呈球状、直径为0.6～1.0 µm，单个或成对排列。扫描电镜照片也证实了菌株S-22具有杆状和球状两种形态（图1）。Biomerieux微生物自动鉴定仪鉴定结果表明，菌株S-22为球型节杆菌（Arthrobacter globiformis），匹配率为89.6%。

图  1  菌株S-22的扫描电镜照片

Fig.  1  Scanning electron microscope image of strain S-22

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2.2   菌株S-22的最佳培养条件

不同碳源对菌株S-22培养液表面张力和OD_{620 nm}的影响如图2所示。以糖类为碳源，OD_{620 nm}代表的生物量可达3.2以上，表面张力可降至35.0 mN/m以下，说明生物量和生物表面活性剂的产率较高，特别是以葡萄糖为碳源时，生物量和生物表面活性剂的产率最高；以花生油为碳源的结果与之类似；以正十六烷、石蜡和原油为碳源时，菌株S-22的生物量降低，而表面张力并没有明显降低。表面张力的降低程度可以反映生物表面活性剂产率^{[4, 11-12]}，通常生物表面活性剂产率越大，表面张力越低。尽管疏水性化合物碳源通常能够显著促进生物表面活性剂的诱导和合成^[13-14]，但也有研究表明：节杆菌能够以亲水性化合物为碳源产生大量的生物表面活性剂^[15]。以上研究结果表明，糖类是菌株S-22生长的最适碳源，菌株S-22在糖类等亲水性化合物碳源中生长代谢迅速，有利于生物表面活性剂的工业化批量生产。

图  2  不同碳源对菌株S-22培养液表面张力和OD_{620 nm}的影响

Fig.  2  Effect of carbon sources on surface tension and OD_{620 nm} in culture of strain S-22

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不同氮源对菌株S-22培养液表面张力和OD_{620 nm}的影响如图3所示。结果表明，以硝酸铵、硝酸钠、氯化铵、硫酸铵和尿素为氮源的培养液生物量较高，表面张力较低，同时起泡量大，说明生物表面活性剂浓度高。进一步研究发现，以尿素和硝酸钠等中性氮源进行培养，培养液的最终pH接近中性，生物表面活性剂浓度较高；而以硝酸铵、氯化铵和硫酸铵等酸性氮源进行培养，生物表面活性剂浓度较低。Davis等人^[16]的研究发现，氮源很可能是调节生物表面活性剂合成的关键因素，本研究结果也印证了这一点，体现了氮源优化的重要性。

图  3  不同氮源对菌株S-22培养液表面张力和OD_{620 nm}的影响

Fig.  3  Effect of nitrogen sources on surface tension and OD_{620 nm} in culture of strain S-22

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初始pH对菌株S-22培养液表面张力、OD_{620 nm}和pH的影响如图4所示。结果表明，初始pH较低时，生物量较小，且表面张力较高。随着初始pH升高，生物量逐渐升高而后降低，在初始pH=6.5时，OD_{620 nm}代表的生物量最大可达6.1；随着初始pH升高，表面张力不断降低，在pH≥7后稳定在33.2 mN/m左右。有文献报道，近中性的pH有助于大多数菌株产生生物表面活性剂^{[12, 17]}。

图  4  初始pH对菌株S-22培养液表面张力、OD_{620 nm}和pH的影响

Fig.  4  Effect of initial pH on surface tension, OD_{620 nm} and pH in culture of strain S-22

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培养温度对菌株S-22培养液表面张力和OD_{620 nm}的影响如图5所示。过高或者过低的培养温度通常会干扰菌株生长代谢，抑制生物表面活性剂合成，培养温度为25 ℃和45 ℃时，生物量明显较低，而培养温度范围为30 ℃～40 ℃时，生物量和生物表面活性剂产率相对较高，特别是在35 ℃时OD_{620 nm}高达6.9，表面张力仅为30.2 mN/m，可以推断此温度下生物表面活性剂的产率也最高。

图  5  培养温度对菌株S-22培养液表面张力和OD_{620 nm}的影响

Fig.  5  Effect of temperature on surface tension and OD_{620 nm} in culture of strain S-22

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综合上述碳源、氮源、初始pH和培养温度对菌株S-22发酵代谢影响的数据结果，同时参考相关文献报道^{[12, 16]}，采用葡萄糖碳源、尿素氮源、初始pH=7.0、培养温度为35 ℃的最佳条件进行发酵培养，分析菌株S-22的生长动力学曲线和表面张力变化（图6）。从图6可以看出，菌株S-22生长动力学曲线呈现典型的“S”形态，生物量在前4 h显著增加，为指数生长期，16 h后生物量达到最大值，进入稳定期。随着生物量的增加，培养液的pH逐渐降低，达到最低点后略有升高。这一现象可能与微生物的有机酸代谢过程有关。培养液表面张力在6 h内迅速下降至30.5 mN/m，后续保持稳定，由此推测6 h生物表面活性剂的积累浓度已经超过CMC。菌株S-22产生生物表面活性剂的速度快，优于大多数文献报道^[14-16]，较高的生物表面活性剂合成速度可以缩短发酵周期，进而可以降低生物表面活性剂的生产成本，有利于工业化批量生产。

图  6  菌株S-22培养液表面张力、OD_{620 nm}和pH的动态变化

Fig.  6  Dynamic change of surface tension, OD_{620 nm} and pH in culture of strain S-22

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2.3   生物表面活性剂组成分析

采用多种有机溶剂提取菌株S-22产生的生物表面活性剂，结果发现，氯仿-甲醇混合液和乙酸乙酯的提取率均较高，考虑到氯仿-甲醇混合液萃取过程的严重乳化和溶剂自身毒性，后续使用乙酸乙酯进行生物表面活性剂的提取。对提取纯化的生物表面活性剂采用TLC、FT-IR和GC-MS等多种技术手段进行综合分析，可以有效鉴定其结构^[11]。

TLC显色结果表明，生物表面活性剂样品中有4种化合物对脂肪酸显色剂呈阳性反应，2种化合物对脂肪醇显色剂呈阳性反应，2种化合物对磷脂显色剂呈阳性反应，3种化合物对糖脂类显色剂呈阳性反应，特别是在R_f=0.57位置存在一块最大斑点（图7），为样品中的主要组分，对糖脂类显色剂呈阳性反应，推测该生物表面活性剂是由糖类和脂类组成的一种糖脂类化合物。

图  7  生物表面活性剂薄层层析

Fig.  7  TLC analysis of biosurfactant

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生物表面活性剂的FT-IR光谱扫描结果如图8所示。样品在3380 /cm附近位置的吸收峰可能为糖环上H-O键伸缩振动所致，在1735 /cm位置的吸收峰可能为酯中C=O键伸缩振动所致，在1032 /cm位置的吸收峰可能为糖环上C-O键伸缩振动所致，在840 /cm位置的吸收峰表明化合物中可能存在吡喃糖苷，因此该生物表面活性剂可能为含双糖或多糖结构的糖脂类化合物。

图  8  生物表面活性剂的傅立叶变换红外光谱

Fig.  8  FT-IR spectra of biosurfactant

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对该糖脂类生物表面活性剂分解产物的水相进行薄层层析分析以鉴定糖类组分，对有机相进行GC-MS分析以鉴定脂肪酸组分。TLC结果显示，其糖类组分的R_f值与海藻糖相同，说明功能糖基是海藻糖。GC-MS分析结果表明，脂肪酸组分主要有2种（图9），经NIST98质谱库检索结果表明，19.259 min脂肪酸组分和21.315 min脂肪酸组分分别与十六烷酸和9-双键十八烷酸的匹配率最高，说明两种脂肪酸分别为十六烷酸和9-双键十八烷酸。由此可以说明，菌株S-22所产糖脂类生物表面活性剂为含有十六烷酸和9-双键十八烷酸的海藻糖脂。由于海藻糖脂具有生物表面活性和免疫调节等多种生物学功能，其合成受到大量研究重视^[18]。目前产生海藻糖脂的微生物主要有：Gordonia属^[19]、Tsukamurella属^[20]和Rhodococcus属^[21]等，且本研究发现Arthrobacter globiformis可以合成海藻糖脂，拓宽了海藻糖脂微生物生产的菌种资源库。

图  9  生物表面活性剂脂肪酸组分的GC-MS分析总离子流图

Fig.  9  Total ion current of GC-MS analysis on fatty acid component of biosurfactant

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2.4   生物表面活性剂特性分析

采用稀释法测定生物表面活性剂的表面张力（图10），计算得到其CMC值为48.5 mg/L，最小表面张力为29.3 mN/m，生物表面活性剂乳化能力可达5.67，说明该生物表面活性剂乳化能力较强。

图  10  不同浓度生物表面活性剂的表面张力

Fig.  10  Surface tension of biosurfactant with different concentration

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生物表面活性剂在100 ℃下保持0.5～4 h，其表面张力处于31.6～33.5 mN/m的狭窄范围（图11）。此外，在0～100 g/L浓度的NaCl作用下，表面张力也没有发生明显变化（图12）。上述分析说明菌株S-22产生的海藻糖脂生物表面活性剂具有较强的耐盐和耐热能力，在高温、高盐等恶劣条件下仍可保持原有的表面张力，有助于生物表面活性剂的工业应用^{[5, 22]}。

图  11  100 ℃下表面张力随时间的变化

Fig.  11  Change of surface tension with time under 100 ºC

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图  12  不同NaCl浓度下表面张力变化

Fig.  12  Change of surface tension with different concentration of NaCl

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3   结 论

通过个体形态、扫描电镜及Biomerieux微生物自动鉴定仪鉴定，分离得到的生物表面活性剂产生菌株S-22为球型节杆菌（Arthrobacter globiformis），以葡萄糖为碳源、尿素为氮源，培养初始pH为7.0，培养温度为35 ℃，培养时间为16 h，是其生长和产生生物表面活性剂的最佳条件。菌株S-22产生生物表面活性剂的速度快，有利于大规模工业生产。综合薄层层析分析、傅立叶变换红外光谱分析和GC-MS分析结果表明，该菌株产生的生物表面活性剂是一种由海藻糖和两种脂肪酸（十六烷酸和9-双键十八烷酸）组成的海藻糖脂，该海藻糖脂表面活性高，临界胶束浓度为48.5 mg/L，具有良好的乳化能力，且耐盐和耐热能力较强，具有很大的潜在应用价值。