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随着经济的不断发展，石油等能源物质需求不断扩大，在石油的海上运输和开采过程中溢油事故不可避免，给海洋环境带来严重污染。海洋微藻作为生产者，最先与海洋表面的溢油污染物质接触，并将毒性富集到更高的营养级中，在生态系统中占据重要地位。在原油的短期和长期作用下，微藻的生长都会受到其毒性效应的影响，光合作用速率下降，呼吸作用增强，生长速率降低[1]。WAF是溢油中最主要的毒性物质，含有大量的多环芳烃，溢油事件中即使不溶性部分被清除，它们也会溶解到水中[2]。当原油WAF浓度高于2.28 mg/L时，将极大地抑制浮游植物的生长，降低Chl a含量和细胞密度[3]。原油WAF的长期毒性效应还会使3种微藻的抗氧化酶活性下降，丙二醛（MDA）含量显著升高，脂质过氧化加剧[4]。Chao等评价了4种燃油WAF对中肋骨条藻和绿藻的毒性效应，F180 WAF的毒性作用最大，其96 h EC50分别为9.41 mg/L和13.63 mg/L[5]。柴油或其WAF浓度的增加同样会增加两种受试微藻的毒性效应，使它们的生长受到不同程度的抑制[6]。因此，寻找一种能够缓解WAF毒性效应、维持藻细胞正常生长代谢的方法十分重要。
截至目前，国内外的研究主要侧重于石油烃等有毒物质对藻类的毒性效应，关于外加碳源缓解溢油毒性效应的研究较少。碳元素是海洋微藻生长所需的重要营养元素，是维持海洋初级生产力的要素之一。适量添加碳源可促进微藻的生长[7-9]。本文以近岸海洋生态系统中常见的小新月菱形藻（ Nitzschia Closterium）为实验对象，研究不同碳源对WAF作用下小新月菱形藻的细胞密度、Chl a、超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛含量和脂肪酸组成的影响，以期为缓解WAF对微藻的毒性效应提供新思路，进而为海洋石油烃污染的生态修复提供新方法。
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小新月菱形藻由国家海洋监测中心（大连）提供。海水取自大连黑石礁海域，盐度为35。用添加Conway培养液的灭菌海水作为营养源，设置温度为20 ℃±1 ℃，光照强度为3000 Lx，光暗周期为12 h∶12 h。实验前，微藻需反复扩培，每天摇动3次，以防微藻下沉或粘附在锥形瓶瓶壁上。
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180#燃料油与灭菌海水按1∶9（v/v）混合，用磁力搅拌器避光搅拌24 h，静置4 h，所得下清液即为石油分散液（WAF），于4 ℃条件下避光保存，使用时按需稀释。
油浓度参考《海洋监测规范 第4部分：海水分析》（GB 17378.4－2007）中的方法测定，测得油浓度为14.2 mg/L。
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在预实验中，5%体积的WAF（对应油浓度为0.71 mg/L）对小新月菱形藻的毒性作用最大，具体设置见表1。实验培养周期为9天，正常组为正常条件下培养的微藻，对照组为溢油胁迫条件下培养的微藻，实验组为溢油胁迫下加入C6H12O6或NaHCO3培养的微藻。C6H12O6浓度为3.0 g/L、6.0 g/L、9.0 g/L；NaHCO3浓度为0.5 g/L、1.5 g/L、3.0 g/L，每组设置3个平行。
正常组 对照组 实验组 海水/mL 450 425 425 WAF/mL 0 25 25 藻液/mL 50 50 50 表 1 各组实验设定
Table 1. Experimental Settings of each group
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将小新月菱形藻藻液按比例稀释成浓度梯度，用紫外—可见分光光度计测定其在684 nm处的吸光度，采用浮游生物计数框法确定细胞密度，建立OD684与对应细胞个数的关系。Chl a的测定采用混合溶剂法，每隔两天取样测定[10]。
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由于小新月菱形藻细胞密度和Chl a含量在第6天和第8天产生的变化较为明显，故选择这两天来探究其在不同条件下的氧化损伤情况。MDA含量、SOD活力均采用试剂盒（Solarbio）测定，每次测定取样10 mL。
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在第2、4、6、8天分别抽取50 mL藻液，经玻璃纤维滤膜（Whatman，GF/F，UK）过滤，于4 ℃条件下保存。将滤膜放入具塞比色管中，加入2 mL盐酸—甲醇混合溶液（14∶86，v/v），70 ℃水浴加热60 min，冷却至室温，加入2 mL正己烷，振荡30 s。静置分层，取上清液到样品瓶。待测样品采用气相色谱－质谱联用仪（GC-MS, Thermo Fisher Scientific, USA）进行分析和鉴定。
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使用SPSS 20.0和Microsoft Excel 软件进行数据的处理及分析，使用Origin 2021制图。
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各条件下小新月菱形藻细胞密度的变化情况如图1所示。培养期间，对照组小新月菱形藻的细胞密度最低，第6天、第8天的细胞密度分别为正常组的67.9%、79.9%。这是由于WAF中的毒性物质进入藻细胞，对藻细胞造成损伤和破坏，导致藻细胞生长速率下降[4]。
图 1 不同条件下小新月菱形藻的细胞密度
Figure 1. The cell density of N.closterium under different conditions
从图1（NaHCO3）可以看出，第1～4天，细胞生长缓慢，4天后，各组细胞密度明显增加，比生长速率最高可达到0.39/d。第8天，NaHCO3浓度为0.5 g/L、1.5 g/L、3.0 g/L组的小新月菱形藻的细胞密度分别为正常组的122%、164%、147%，1.5 g/L NaHCO3对小新月菱形藻细胞密度的作用效果最好。Zhao等探究了NaHCO3对微藻的影响，结果表明，NaHCO3在一定程度上可以增加微藻的生物量[11]。石油烃进入细胞的方式主要为被动运输、主动运输和内吞，只有一小部分分子量小的石油烃可以通过自由扩散进入细胞，且转运过程需要载体蛋白参与[12]。而NaHCO3的利用相对容易，微藻优先利用NaHCO3提供的碳源，减弱了对WAF的降解利用。因此，水中毒性物质减少，细胞密度增加。
从图1（C6H12O6）可以看出，第4～7天，添加C6H12O6使小新月菱形藻细胞密度高于对照组，最高为正常组的156%。第6天，C6H12O6浓度为3.0 g/L、6.0 g/L、9.0 g/L组的细胞密度分别为正常组的120%、113%、103%。随着C6H12O6浓度的升高，细胞密度增长减缓。8天以后，3个C6H12O6组的细胞密度都低于对照组。高浓度C6H12O6组培养后期，藻液浑浊发白，生长状况变差，可能是小新月菱形藻对C6H12O6的利用效果不佳。
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图2是小新月菱形藻Chl a含量随时间的变化情况。在整个培养过程中，对照组小新月菱形藻的Chl a含量一直低于正常组。第8天，WAF对小新月菱形藻Chl a的抑制率为11.22%。WAF在微藻中的积累能够造成叶绿体收缩、基质减少、类囊体膨胀等现象，使叶绿体结构遭到破坏。因此，微藻的初级光化学产量降低，电子输运能力下降，PSII和释放氧中心活性被抑制，同时，微藻的呼吸作用增强，能量消耗加速[13]。
图 2 不同条件下小新月菱形藻的Chl a含量
Figure 2. The Chl a content of N.closterium Under different conditions
从图2（NaHCO3）可以看出，前4天，NaHCO3组小新月菱形藻的Chl a含量低于正常组，4天后，Chl a含量明显超过正常组和对照组，NaHCO3使受WAF毒性效应降低的Chl a含量有所增加，这与细胞密度的变化趋势一致。1.5 g/L NaHCO3的作用效果最明显，第8天，其Chl a含量是正常组的2.35倍，是对照组的2.65倍。Chl a含量的增加能够使微藻产生更高的光合效率，这表明适量的NaHCO3能够促进微藻的生长和生物量的累积[14]。
从图2（C6H12O6）可以看出，C6H12O6使小新月菱形藻的Chl a含量远低于正常组和对照组水平，对Chl a的抑制率最高达到74.4%。外加C6H12O6使得WAF胁迫下小新月菱形藻的光合效率下调，氧气释放停止，光合器官丧失，类囊体的超微结构随着膜的减少而发生显著变化，从而导致小新月菱形藻的光合作用受到抑制，呼吸作用增强，出现藻液发白和藻细胞裂解的现象[15-16]。
两种碳源的添加形成了截然不同的结果，这可能是因为微藻对不同碳源有不同的利用途径。当外加C6H12O6时，微藻利用C6H12O6进行呼吸作用，先通过糖代谢途径生成乙酰辅酶A（acetyl-CoA），再进入三羧酸循环（TCA cycle）。当外加NaHCO3时，微藻利用溶解无机碳（主要以CO2、HCO3−、CO32−和H2CO3形式存在）作为碳源进行光合作用。因此，NaHCO3对WAF胁迫下小新月菱形藻的生长更有利。
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MDA是衡量细胞脂质过氧化程度最常见的指标，其含量的变化可以间接反映藻细胞遭受胁迫的强弱以及细胞氧化损伤的程度[17]。小新月菱形藻的MDA含量变化如图3所示。对照组第6天、第8天的MDA含量分别是正常组的1.44倍、1.14倍，小新月菱形藻脂质过氧化严重。因为石油烃在进入藻细胞后，可通过自身或中间代谢产物的氧化还原反应产生大量活性氧自由基，如·OH、·O2−、H2O2等。
图 3 不同条件下小新月菱形藻的MDA含量
Figure 3. The MDA content of N.closterium Under different conditions
NaHCO3组MDA含量均低于对照组，并且随着NaHCO3浓度的升高，MDA含量逐渐降低。第8天，各浓度分别使胁迫下小新月菱形藻的MDA含量降低了17.5%、46.7%、49.7%。这意味着外加NaHCO3可降低藻细胞因WAF胁迫产生的脂质过氧化。外加6.0 g/L和9.0 g/L C6H12O6均使MDA含量高于对照组，特别是第8天，脂质过氧化加重，加深了WAF对小新月菱形藻的毒性效应。刘浩等的研究表明，低浓度C6H12O6对藻细胞生长呈促进作用，而高浓度C6H12O6可能会改变细胞渗透压，使藻细胞原有形态受到影响，并抑制自身代谢[18]，这与本实验的现象相似。
不同条件下小新月菱形藻的SOD活力如图4所示。第6天，WAF胁迫下小新月菱形藻SOD活力是正常组的2.43倍，这是藻细胞对不利环境积极应激的表现。随着培养时间的延长，藻细胞可能通过自身调节代谢掉部分毒性，SOD活力逐渐下降。
图 4 不同条件下小新月菱形藻的SOD活力
Figure 4. The SOD activity of N.closterium Under different conditions
第6天和第8天，NaHCO3使WAF胁迫下SOD活力均低于对照组，第6天，3.0 g/L NaHCO3使SOD活力下降最多，为0.011 U/104cell。外加NaHCO3可能使藻细胞对WAF的利用率不高，细胞内产生的活性氧自由基较少，藻细胞的抗氧化防御系统能够将其清除。3.0 g/L C6H12O6能够刺激SOD活力使其增加，但随着C6H12O6浓度升高，SOD活力明显下降，表明C6H12O6浓度过高会超出小新月菱形藻自身的调节范围，活性氧自由基产生和清除的平衡被打破，SOD活力受到抑制。
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小新月菱形藻属硅藻门，其常见的4种脂肪酸为C14:0、C16:0、C16:1n-7、C20:5n-3（EPA）。脂肪酸是微藻体内重要的代谢产物，是脂质的组成单元，在环境受到污染时，它可以通过改变脂质代谢和脂肪酸组成来抵抗外界不良因素[19]。
图5为不同浓度NaHCO3对溢油胁迫下小新月菱形藻脂肪酸组成的影响。第2天，WAF胁迫使对照组C18:3n-6的比例增加4%，C16:0的比例减少2%，C16:1n-7的比例减少5%；0.5 g/L NaHCO3组与对照组脂肪酸比例相似，1.5 g/L和3.0 g/L NaHCO3则与正常组比例相似。这可能是因为1.5 g/L和3.0 g/L NaHCO3组的小新月菱形藻先利用外加的碳源来进行代谢活动，基本不受WAF胁迫影响，而对照组和0.5 g/L NaHCO3组的藻细胞受WAF毒性作用影响，通过加强PUFAs的合成来调节自身防御系统[20]。
图 5 NaHCO3对溢油胁迫下小新月菱形藻脂肪酸组成的影响
Figure 5. The effects of NaHCO3 on fatty acid composition of N.closterium under oil spill stress
第4天，与正常组相比，对照组C20:5n-3的比例由26%减少到24%，而C16:0的比例由19%增加至22%。第6天，对照组C20:5n-3的比例比正常组低4%，这是因为不饱和脂肪酸受到活性氧自由基的攻击发生了脂质过氧化。NaHCO3组C20:5n-3的比例则高于正常组和对照组，NaHCO3的添加使藻细胞密度和代谢速度增加，促进脂肪酸从饱和脂肪酸向不饱和脂肪酸转化，从而使脂肪酸组成发生改变[21,22]。培养第8天，各处理组脂肪酸组成基本相同。
图6为不同浓度C6H12O6对溢油胁迫下小新月菱形藻脂肪酸组成的影响，变化最明显的为C18:1n-9和C20:5n-3。培养期间，C18:1n-9的比例一直高于正常组和对照组，最高可达27%，随培养时间先增加后减少，C6H12O6浓度越高，C18:1n-9的比例越小。与正常组、对照组相比，C20:5n-3的比例在第2天减少5%～9%，第4天减少16%～21%，合成受到明显抑制，从第6天开始慢慢增加。外加C6H12O6还使小新月菱形藻C16:0的比例增加，随C6H12O6浓度升高而增加。Regnault等利用有机碳源培养纤细裸藻（Euglena gracilis）得到的结果与本实验现象一致[23]。单不饱和脂肪酸（MUFAs）增加的原因可能是外加C6H12O6使WAF胁迫下小新月菱形藻脂质过氧化加重，与光合作用有关的PUFAs减少，PSI和PSII活性降低。小新月菱形藻的光合作用受到抑制，导致细胞密度增长较慢，甚至不增长，不需要合成更多的膜化合物，对PUFAs的需求下降，而MUFAs以TAG的形式被存储起来[24]。
图 6 C6H12O6对溢油胁迫下小新月菱形藻脂肪酸组成的影响
Figure 6. The effects of C6H12O6 on fatty acid composition of N.closterium under oil spill stress
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（1）在180#燃料油WAF胁迫下，小新月菱形藻细胞内活性氧自由基产生过量，脂质过氧化加剧，可能导致藻的细胞膜、类囊体膜被破坏。小新月菱形藻的光合作用和脂肪酸合成途径受到影响，细胞密度下降。
（2）添加NaHCO3为小新月菱形藻提供了充足的无机碳源，减少了对WAF中碳的利用，使细胞内活性氧自由基减少，脂质过氧化水平降低；同时，小新月菱形藻的光合作用增强，细胞密度增加，对膜化合物的需求增加，需要合成更多的PUFAs。微藻生长状况良好，WAF形成的毒性效应得到有效缓解。
（3）低浓度C6H12O6对WAF毒性效应的缓解效果一般，而在高浓度C6H12O6作用下小新月菱形藻的MDA含量增加，PUFAs比例下降，光合速率和细胞密度的增加受到抑制，导致WAF毒性效应加重。MUFAs比例上升，并转为TAG被存储起来。
不同碳源对溢油胁迫下小新月菱形藻毒性缓解作用研究
Effects of different carbon sources on mitigation of toxicity of oil spill to Nitzschia Closterium
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摘要: 为缓解海上溢油胁迫对海洋微藻的毒性效应，添加不同碳源可能是有效途径之一。本文以小新月菱形藻（Nitzschia closterium）为实验材料，通过添加不同浓度的葡萄糖（C6H12O6）和碳酸氢钠（NaHCO3），探究在180#燃料油分散液（WAF）胁迫下外源碳源对其毒性效应的缓解作用。结果表明，在不同浓度NaHCO3的作用下，小新月菱形藻的细胞密度和叶绿素a（Chl a）含量增加，脂质过氧化水平降低，培养4天后，脂肪酸组成与正常组基本一致，毒性效应得到明显缓解。不同浓度的C6H12O6均降低了小新月菱形藻Chl a含量，C18:1n-9比例明显增加。低浓度C6H12O6对WAF胁迫下小新月菱形藻毒性效应的缓解作用较小，高浓度C6H12O6加重了WAF的毒性效应，导致了更严重的脂质过氧化。因此，添加适宜浓度的NaHCO3能在一定程度上缓解WAF对小新月菱形藻的毒性效应。Abstract: In order to alleviate the toxic effects of offshore oil spill stress on Marine microalgae, adding different carbon sources may be one of the effective ways. By adding different concentrations of glucose (C6H12O6) and sodium bicarbonate (NaHCO3), the alleviation effect of exogenous carbon sources on the toxicity of Nitzschia closterium under 180# fuel oil dispersion (WAF) stress was investigated. Under different concentrations of NaHCO3, the cell density and Chl a content increased, while the level of lipid peroxidation decreased. Four days later, the fatty acid composition of N. closterium was basically the same as that of the normal group, and the toxic effect was obviously relieved. Different concentrations of C6H12O6 reduced the content of Chl a in N. closterium and increased its C18:1n-9 ratio significantly. Low concentration of C6H12O6 had less alleviation effect on the toxic effect of N. closterium under WAF stress, while high concentration of C6H12O6 aggravated the toxic effect of WAF, resulting in more serious lipid peroxidation. Therefore, adding an appropriate concentration of NaHCO3 could alleviate the toxic effect of WAF on N. closterium to a certain extent.
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Key words:
- Nitzschia closterium /
- WAF /
- lipid peroxidation /
- fatty acid composition
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图 1 不同条件下小新月菱形藻的细胞密度
Figure 1. The cell density of N.closterium under different conditions
图 2 不同条件下小新月菱形藻的Chl a含量
Figure 2. The Chl a content of N.closterium Under different conditions
图 3 不同条件下小新月菱形藻的MDA含量
Figure 3. The MDA content of N.closterium Under different conditions
图 4 不同条件下小新月菱形藻的SOD活力
Figure 4. The SOD activity of N.closterium Under different conditions
图 5 NaHCO3对溢油胁迫下小新月菱形藻脂肪酸组成的影响
Figure 5. The effects of NaHCO3 on fatty acid composition of N.closterium under oil spill stress
图 6 C6H12O6对溢油胁迫下小新月菱形藻脂肪酸组成的影响
Figure 6. The effects of C6H12O6 on fatty acid composition of N.closterium under oil spill stress
表 1 各组实验设定
Table 1. Experimental Settings of each group
正常组 对照组 实验组 海水/mL 450 425 425 WAF/mL 0 25 25 藻液/mL 50 50 50 
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