在过去的几十年，塑料的大量使用和丢弃造成了严重的环境问题。大型塑料垃圾经过一系列的物理、化学和生物作用后，可破碎形成微塑料（0.1～5 mm），甚至是纳米塑料（<100 nm）^[1-2]。有研究估计，海洋表面漂浮着至少5.25 万亿个塑料颗粒，重量近27 万吨^[3]。这些塑料颗粒能随着风力和洋流进行远距离迁移，使得海洋塑料污染成为全球性环境问题^[4]。研究表明，纳米塑料的大小、颜色与许多水生生物的食物相似，因此很容易被误食，并且纳米塑料能在食物链中不断传递并富集，对海洋生物的健康和生存构成严重威胁^[5]。同时，纳米塑料具有体积小、比表面积大、疏水性强等特点，因此可以吸附大量污染物（如重金属、持久性有机污染物等），并作为载体将吸附的污染物转移至生物体内，进一步加剧对海洋生物的生态毒性效应^[6]。此外，在海浪侵蚀、紫外线辐射、生物降解等作用影响下，纳米塑料表面常形成一些含氧或含氮官能团（如-COOH和-NH₂），从而影响其物理化学性质、环境行为及毒理效应^[7]。

双壳贝类是一种世界性分布的滤食性海洋生物，具有很强的海水过滤能力，因此被广泛地用作海洋污染的指示生物^[8]。研究证实，纳米塑料在双壳贝类体内的蓄积会对其摄食行为^[9]和繁殖造成负面影响^[10]，并且会导致双壳贝类产生炎症反应、组织病理变化^[11]、氧化应激和神经毒性等^[12]。目前，国内外针对纳米塑料对双壳贝类的毒理效应研究主要采用牡蛎、贻贝等受试动物，而对其他双壳贝类的毒理效应研究较少。聚苯乙烯塑料广泛应用于日常生产及生活中，是全球产量最高的塑料类型之一，也是海洋、淡水和河流环境中检出的主要塑料类型之一^[13]。因此，本文选择不同官能团的聚苯乙烯纳米塑料作为研究对象，使用南海典型的经济贝类波纹巴非蛤（Paphia undulata）作为受试生物，将其暴露于含500 μg/L不同官能团聚苯乙烯纳米塑料的海水中48 h，研究纳米塑料在波纹巴非蛤体内的富集分布特征，揭示纳米塑料胁迫对波纹巴非蛤组织器官中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）、谷胱甘肽（glutathione, GSH）以及丙二醛（malondialdehyde, MDA）等抗氧化防御系统相关指标的影响，为探究纳米塑料对海洋底栖贝类的生态毒性效应及相关毒性机理奠定基础。

1   材料与方法

1.1   实验动物及其驯化

波纹巴非蛤从三亚附近海域获取，置于实验室大型水族箱中暂养驯化（温度25 ℃ ± 1 ℃，盐度30 ± 1，连续充气，光暗比为12 h / 12 h）。每日投喂螺旋藻粉饲料（体重的1%）一次，实验用水为水族专用海盐配制的人工海水（盐度30 ± 1）。受试动物在此条件下驯化7 d。选取个体大小相近、健康的波纹巴非蛤（壳长3.41 cm ± 0.28 cm，体重4.60 g ± 0.88 g）作为受试动物进行分组实验。

1.2   毒理暴露实验

实验所用纳米塑料分别为不同官能团荧光聚苯乙烯颗粒（PS-NH₂、PS-COOH，粒径80 nm，天津倍思乐中心），分别设计实验对照组（过滤海水）、微塑料暴露组（PS-NH₂、PS-COOH，浓度为500 μg/L）3 个实验组，每组3 个平行鱼缸（体积为15 L）。将驯化后的波纹巴非蛤按照设置的实验条件随机分组，暴露48 h。每日投喂螺旋藻粉饲料（体重的1%）一次，并在1 h后更换全部海水。

1.3   组织样品采集

波纹巴非蛤暴露48 h后，将其迅速放置在冰上解剖。每组取6只波纹巴非蛤，分别取出其外套膜、消化腺、鳃、肠和足部，用预冷的超纯水淋洗3 遍，并用吸水纸吸干水分，将样本置于−20 ℃冰箱中保存，并将每两只个体的相应组织合并为一个样本，用于测定组织中纳米塑料的含量。每组取3只波纹巴非蛤，解剖取出完整的消化腺和肠道组织，立即加入4%的多聚甲醛溶液固定，用于后续切片处理，以观测组织中纳米塑料的分布。每组取12只波纹巴非蛤，解剖后取出其外套膜、消化腺和鳃组织，迅速置于液氮中冷冻，再转至−80 ℃冰箱中保存，将每3只个体的相应组织合并为一个样本，用于测定组织中生物标志物的含量。

1.4   组织中纳米塑料含量的测定

将波纹巴非蛤组织样本置于8 mL 10% KOH溶液中，于60 ℃消解12 h，再加入2 mL 30% H₂O₂溶液继续消解12 h，消解完成后用超纯水定容至10 mL^[14]。使用荧光分光光度计（Agilent Cary Eclipse G9800A, USA）设置激发波长488 nm和发射波长518 nm，测量各样品消解液的荧光强度。通过建立荧光PS-NH₂和PS-COOH溶液的标准曲线，对纳米塑料在组织中的含量进行定量分析^[15]。

1.5   组织中纳米塑料的观测

使用4%的多聚甲醛溶液固定消化腺和肠道组织1 h，经水洗、乙醇梯度干燥、二甲苯透明处理后浸蜡包埋，每个样本制作3 张组织切片。采用激光共聚焦显微镜（FV3000，日本奥林巴斯）在激发波长488 nm处对组织切片进行观测，分析荧光纳米塑料在组织中的微观分布特征^[16]。

1.6   组织中生物标志物的测定

取波纹巴非蛤外套膜、消化腺和鳃组织称重，按重量（g）∶体积（mL）=1∶9的比例，加入9倍预冷的生理盐水，用组织研磨仪制备10%组织匀浆液，于2500 r/min 离心10 min后取上清液待测。总蛋白定量测试盒（BCA法）、SOD试剂盒（WST-1法）、CAT可见光试剂盒、MDA测定试剂盒、GSH测定试剂盒（微板法）均采购自南京建成生物工程研究所。根据试剂盒操作步骤进行各标志物的分析，采用酶标仪（Molecular Devices，SpectraMax ID3）进行测定。

1.7   数据统计分析

采用 SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。通过Kolmogorov-Smirnov单样本检验和Levene方差齐性检验来评估数据的正态性和方差齐性，再对数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA），评价不同实验组间测量结果的统计学差异（p值小于0.05考虑为差异显著），同时对生物标志物和组织中的纳米塑料含量进行Pearson相关性分析。采用SIMCA 13软件进行主成分分析（principal component analysis, PCA）。

2   结果与讨论

2.1   纳米塑料在波纹巴非蛤各组织中的蓄积特征

利用荧光分光光度计分别建立相应荧光纳米塑料的标准曲线（PS-NH₂为y=1.05869x，R²=0.9969；PS-COOH为y=1.2288x，R²=0.9977），对波纹巴非蛤各组织中的纳米塑料含量进行定量分析。波纹巴非蛤暴露于不同官能团聚苯乙烯纳米塑料中48 h后，其外套膜、消化腺、鳃、肠道及足部中富集的纳米塑料含量如图1所示。结果表明，波纹巴非蛤体内纳米塑料富集含量最高的组织为消化腺，该组织中富集的PS-NH₂和PS-COOH纳米塑料平均含量分别为0.34 μg/mg和0.14 μg/mg；外套膜和鳃中纳米塑料含量较低，平均值小于0.07 μg/mg；足部中纳米塑料含量极低，平均值小于0.02 μg/mg。统计分析显示，消化腺中PS-NH₂纳米塑料的富集含量显著高于其他4 种组织（p<0.05）；PS-COOH纳米塑料在消化腺和肠道的富集含量均显著高于外套膜、鳃和足部（p<0.05）。比较两种官能团聚苯乙烯纳米塑料在不同组织中蓄积含量可知，消化腺富集的PS-NH₂纳米塑料含量显著高于PS-COOH纳米塑料含量（p<0.05），而外套膜富集的PS-COOH纳米塑料含量略高于PS-NH₂纳米塑料（p<0.05）。

图  1  不同官能团聚苯乙烯纳米塑料在波纹巴非蛤各组织的含量

[同一处理中的不同字母表示组织之间纳米塑料含量差异显著，*表示不同处理之间差异显著(p<0.05)]

Fig.  1  Content of polystyrene nanoplastics of different functional groups in the tissues of P. undulata

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研究表明，与微塑料相比，纳米塑料更容易进入动物体内并在不同器官之间迁移，同时众多体外和体内实验也证明了纳米塑料穿透不同生物屏障的潜力^[5]。波纹巴非蛤是滤食性双壳贝类，摄食时由于外套膜及鳃表面纤毛的打动，较小的食物颗粒被传送到鳃丝腹缘的食物沟中，继而被吞食转移至消化系统，最后在消化腺和肠中积累^[17]。本实验中采用的聚苯乙烯纳米塑料颗粒尺寸仅为80 nm，这可能是消化腺中纳米塑料蓄积的主要原因。

同时，本研究发现，由于官能团本身特性以及生物组织对纳米塑料的吸收途径不同，导致波纹巴非蛤对两种塑料的富集情况存在差异。其中，消化腺对PS-NH₂纳米塑料蓄积能力显著高于PS-COOH纳米塑料，而外套膜对两种塑料的蓄积能力则相反。研究表明，与PS-COOH颗粒相比，PS-NH₂颗粒具有相对较小的流体动力学直径和较高的分散性，因此，后者更容易富集于消化腺且内化至上皮细胞中，并通过循环系统转移至其他器官^[18]；而PS-COOH颗粒分散性较差，容易团聚成较大颗粒，较难穿透生物屏障在消化腺中蓄积，可能导致贝类更容易将海水环境中的PS-COOH颗粒吸附在外套膜表面上^[19]。

2.2   纳米塑料在波纹巴非蛤消化腺和肠道中的分布特征

针对纳米塑料富集最多的消化腺和肠道组织，进一步利用激光共聚焦显微镜研究荧光纳米塑料在组织内的微观分布特征。由图2可知，波纹巴非蛤消化腺和肠道中均可观测到较为明显的荧光纳米塑料。在消化腺中，两种纳米塑料主要蓄积于腺体上皮细胞及消化管腔壁，部分纳米塑料团聚为较大颗粒；其中PS-NH₂纳米塑料在消化腺内的团聚现象比PS-COOH更明显，其团聚后的最大尺寸为5.59 μm。这可能是由于纳米颗粒自身的团聚特性以及纳米塑料与生物大分子相互作用发生异相凝聚的共同结果^[16]。在肠道组织中，两种纳米塑料均主要蓄积在肠道壁及肠道中，尤其趋向于在肠道绒毛处富集并团聚。

图  2  激光共聚焦显微镜下纳米塑料在波纹巴非蛤消化腺和肠道中的分布情况

Fig.  2  Distribution of nano-plastics in digestive gland and intestinal tract of P. undulata under confocal laser microscopy

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2.3   纳米塑料胁迫对波纹巴非蛤体内生物标志物的影响

在不同暴露条件下，波纹巴非蛤外套膜、消化腺以及鳃组织中的抗氧化酶、细胞损伤和脂质过氧化水平的变化如图3所示。结果显示，与对照组相比，PS-NH₂纳米塑料暴露导致波纹巴非蛤外套膜、消化腺及鳃3类组织器官中SOD活性显著升高，而PS-COOH纳米塑料暴露仅引起波纹巴非蛤鳃中SOD活性显著升高（p<0.05）；相比PS-COOH纳米塑料，在PS-NH₂纳米塑料暴露条件下的消化腺中SOD活性更高（p<0.05）；两种塑料均未导致波纹巴非蛤外套膜、消化腺及鳃中CAT酶活性的显著变化，但都引起外套膜中GSH含量显著升高（p<0.05）；PS-NH₂纳米塑料暴露导致波纹巴非蛤鳃中MDA含量显著升高（p<0.05）；相比PS-NH₂纳米塑料，在PS-COOH纳米塑料暴露条件下的消化腺中MDA含量显著升高（p<0.05）。

图  3  不同暴露条件下波纹巴非蛤各组织内生物标志物活性/含量变化

[同一组织中不同字母表示各处理之间差异显著(p<0.05)]

Fig.  3  Changes in the activity/content of biomarkers in the tissues of P. undulata under different exposure

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SOD是双壳类海洋动物体内抗氧化防御系统的第一道防线，可防止机体的氧化损伤。SOD可以催化超氧自由基（·O₂⁻）转化为过氧化氢（H₂O₂）和分子氧（O₂），用来清除生物体受到外界环境胁迫时产生的活性氧（ROS）^[20]。本研究发现，波纹巴非蛤暴露于500 μg/L的PS-NH₂纳米塑料环境中48 h后，其外套膜、消化腺和鳃组织中SOD活性被显著激活，而同样条件下，PS-COOH纳米塑料暴露仅导致其鳃组织中SOD活性被激活。这表明两种纳米塑料均可不同程度地诱导波纹巴非蛤的氧化应激反应，但对不同组织中SOD活性的诱导效率存在差异。有研究表明，浅沟长舌蛤（Scrobicularia plana）暴露于粒径20 μm、浓度1 mg/L的聚苯乙烯微塑料海水环境中7 d和14 d后，其鳃组织具有相似的SOD响应特征，且消化腺中SOD活性也在暴露14 d后被显著激活^[12]。

CAT是生物体内抗氧化防御系统的重要组成部分，可以催化组织内H₂O₂分解生成氧气（O₂）和水（H₂O）^[21]。本实验未发现PS-NH₂和PS-COOH纳米塑料对受试动物体内CAT活性有显著影响。由于抗氧化酶活性的响应特征与生物个体以及暴露塑料的粒径、类型、剂量和暴露时间等因素有关，可能CAT并非波纹巴非蛤用于响应急性聚苯乙烯纳米塑料暴露的主要抗氧化防御机制。同样，Francisca等人将浅沟长舌蛤暴露在粒径20 μm、浓度1 mg/L的聚苯乙烯微塑料中7 d和14 d，该受试动物鳃和消化腺中的CAT活性也未受到显著影响^[12]。

GSH是抗氧化防御系统中用于防止各种外源性物质氧化脂质和蛋白质的关键成分之一，在细胞内能与SOD和CAT一起将·O₂⁻和H₂O₂还原为H₂O，使得通过中间体生成高活性膜过氧化剂（·OH）的反应链中断，从而保护细胞免受活性氧自由基的伤害^[22]。本研究结果显示，两种官能团纳米塑料均导致波纹巴非蛤外套膜中GSH含量显著升高，但未引起鳃和消化腺中GSH含量的显著变化。Li等人将河蚬（Corbicula fluminea）暴露在3 种不同浓度的聚苯乙烯纳米塑料（80 nm）中96 h，结果表明，与对照组相比，当纳米塑料浓度为0.1 mg/L和1.0 mg/L时，河蚬外套膜中GSH含量也显著升高（p<0.05）；但高浓度（5.0 mg/L）组的鳃、外套膜及内脏团中GSH含量均无明显变化，这表明GSH水平可能会受到暴露实验中所用塑料浓度的影响^[16]。

过度氧化应激可能导致氧化损伤，MDA是脂质氧化损伤的最终产物，因此，MDA含量是反映脂质过氧化速率和强度的重要参数^[23]。本研究中，PS-NH₂纳米塑料暴露导致波纹巴非蛤鳃中MDA含量显著升高，表明波纹巴非蛤鳃中出现了脂质过氧化损伤迹象。相关研究表明，河蚬暴露于5.0 mg/L聚苯乙烯纳米塑料（80 nm）96 h后，其鳃组织中的MDA含量显著升高，与本实验结果相似^[16]。

本研究采用波纹巴非蛤的鳃、外套膜及消化腺组织中生物标志物指标建立PCA模型（图4），两个主成分共解释总方差的81.9%。第一主成分（PC1）对模型的贡献率占64.9%，鳃SOD活性、外套膜GSH含量、消化腺CAT活性、鳃MDA含量、外套膜和消化腺SOD活性在PC1上均具有较高的正载荷（>0.6）。第二主成分（PC2）对模型的贡献率占17.0%，其中消化腺SOD活性和GSH含量在PC2上分别具有最高的正载荷和负载荷。图4同时展示了PCA模型得分和载荷的情况。从图中可以看出，对照组、PS-COOH和PS-NH₂暴露组的聚类趋势明显，表明3 个实验组之间的生物标志物指标存在显著差异。通过模型载荷图，可进一步挖掘波纹巴非蛤生物标志物对不同纳米塑料暴露的响应特征。结果表明，PS-NH₂暴露组中3 类组织的SOD活性水平均较高，同时，鳃中MDA含量和消化腺中CAT活性也存在升高趋势；PS-COOH暴露组中鳃组织的SOD活性、CAT活性及MDA含量均位处于较高水平，外套膜中GSH含量以及消化腺中GSH和MDA含量也较高。

图  4  波纹巴非蛤生物标志物的PCA得分和载荷图

（生物标志物的后缀d，g和m分别代表消化腺、鳃和外套膜组织）

Fig.  4  PCA scores and loadings plots for biomarkers of P. undulata

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此外，Pearson相关性分析显示，波纹巴非蛤消化腺中纳米塑料含量与消化腺的SOD活性呈显著正相关性（R=0.863，p<0.05），而其余生物标志物与相应组织中纳米塑料含量无显著相关性。这表明波纹巴非蛤组织中富集更多的纳米塑料后，可进一步促使其组织中SOD活性被显著激活，氧化与抗氧化系统的失衡导致组织出现脂质过氧化损伤等现象。后续研究可从分子、细胞层面及代谢角度进一步探究不同官能团纳米塑料对波纹巴非蛤的毒性机制。

3   结 论

（1）PS-NH₂和PS-COOH纳米塑料在波纹巴非蛤体内的富集规律大致相似，但富集情况存在差异。两种纳米塑料在波纹巴非蛤消化腺中的富集量最多，肠道次之，外套膜和鳃较少；消化腺对PS-NH₂纳米塑料的蓄积能力显著高于PS-COOH纳米塑料。

（2）两种纳米塑料均不同程度地影响波纹巴非蛤的抗氧化能力。PS-NH₂纳米塑料可显著诱导波纹巴非蛤外套膜、消化腺及鳃组织的SOD活性，而PS-COOH纳米塑料仅导致鳃组织SOD活性显著升高；两种纳米塑料暴露均导致波纹巴非蛤外套膜中GSH含量显著升高，但对CAT活性没有显著影响。

（3）两种纳米塑料均可导致波纹巴非蛤组织的脂质过氧化损伤。PS-NH₂纳米塑料促使波纹巴非蛤鳃中MDA含量显著升高；相比PS-NH₂纳米塑料，在PS-COOH纳米塑料暴露条件下的消化腺中MDA含量更高。