实验所用浒苔采集自青岛沿海，实验室内传代培养，培养基为f/2-si。光照培养箱培养条件为：温度（24 ± 2） ℃，光照强度4000 lx，光照周期12 h∶12 h。

采用断裂的方法诱导浒苔释放孢子，将收集到的孢子迅速计数，用于实验。

实验用油为原油和0^#柴油，原油采集自江苏油田，0^#柴油为加油站购买。将两种油分别和无菌海水按体积比1∶10混合，搅拌，同时用超声处理6 h，将超声处理后的悬浊液转移至分液漏斗中，静置72 h，取下清液（即为WAFs母液）经0.22 μm醋酸纤维滤膜过滤，于4 ℃条件下避光保存滤液待用。

采用紫外分光光度法测定WAFs母液浓度。分别配制2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L的石油类标准液，以正己烷为对照，225 nm处测定吸光度，绘制标准曲线$ y = 0.0267x - 0.0114 $，R² = 0.9965。根据标准曲线计算得出原油和0^#柴油的WAFs母液浓度分别为20 mg/L和26 mg/L，实验时按需稀释。

将浒苔孢子（0.8×10⁴ cells/mL）接种到6孔板中，内装5 mL f/2培养液。每个6孔板内放1片灭菌盖玻片，便于计数附着的孢子量。其中实验组为石油烃浓度分别为12 mg/L、3 mg/L的柴油水溶液和原油水溶液，对照组为不含石油烃的灭菌海水。每组设置3个平行，避光培养24 h，以保证孢子的随机附着。24 h后取出盖玻片，在灭菌海水中轻微震荡数次，洗去未附着的孢子。光学显微镜下随机观察20 个视野（40 × 10 倍），取其平均值计算附着的孢子量。

预先将浒苔孢子（0.8×10⁴ cells/mL） 接种到内装5 mL f/2培养液的6孔板中，避光24 h以保证其随机附着。实验开始时将其转移至光照培养箱中，并分别加入石油烃浓度为12 mg/L、3 mg/L的柴油水溶液和原油水溶液作为实验组，对照组为不含石油烃的孢子单培养组。分别于24 h、48 h、72 h、96 h在光学显微镜下观察盖玻片上孢子的萌发率，每个盖玻片计数20 个视野。萌发率计算公式如下：

式中：G为萌发率；X为一个视野中总的孢子数；Y为一个视野中萌发的孢子数。

将萌发7 d的幼苗（长度2 mm左右）接种于6孔板内，内装8 mL f/2培养液。实验组加入不同浓度的石油烃水溶液，对照组加入等量灭菌海水，每个处理设置3个平行，在光照培养箱中培养。试验周期为8 d，每2 d用直尺测量幼苗长度。

称取0.5 g浒苔藻体于装有200 mL f/2培养液的三角烧瓶中培养，实验组和对照组设置及培养条件均同1.2.2节，试验周期为7 d，并分别在12 h、24 h、72 h、168 h测量以下各参数。

（1）生长率（RGR）测定

用吸水纸充分吸取藻体表面水分，称得鲜重，通过如下公式计算其生长率（RGR）：

式中：W₀为初始鲜重（g）；W_t为第t d时鲜重（g）；t为培养时间（d）。

（2）叶绿素a（Chl a）和类胡萝卜素（Car）测定

取0.1 g藻体加入10 mL甲醇并于4 ℃条件下提取24 h，2500 r/min离心10 min，以甲醇为空白对照，测定665 nm、652 nm、510 nm、480 nm波长下的吸光值，计算公式如下：

式中：V为甲醇含量（mL）；W为藻体质量（g）。

（3）可溶性蛋白及可溶性糖含量测定

可溶性蛋白含量采用以牛血清蛋白为标准液的考马斯亮蓝法测定。可溶性糖含量采用以葡萄糖为标准液的苯酚—硫酸法测定。

（4）超氧化物歧化酶及过氧化氢酶测定

酶活性采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD） 活性的测定采用黄嘌呤氧化酶法，过氧化氢酶（Catalase, CAT） 活性的测定采用钼酸铵法。

实验数据采用Excel 2019作图，采用SPSS 20软件对数据进行统计分析。采用双因素方差进行差异显著性分析，显著性水平设置为α = 0.05。图表中所得数据均为平均值±标准差。

从图1可以看出，在柴油作用下，两浓度处理组中浒苔孢子的附着量均显著低于对照组（P<0.05），且高浓度的影响效应大于低浓度。在原油处理下，仅高浓度组中浒苔孢子的附着量显著低于对照组（P<0.05），而低浓度处理组的影响效应较小（P>0.05）。因此，不同石油烃对浒苔孢子附着的毒性效应为高浓度柴油>高浓度原油>低浓度柴油>低浓度原油。

图  1  不同石油烃对浒苔孢子24 h附着的影响

Figure 1.  Effects of different petroleum hydrocarbons on the adhesion of Ulva prolifera spores after 24 h

双因素方差分析结果表明（表1），不同石油烃处理、胁迫时间及二者交互作用（处理×时间）对浒苔孢子萌发均有显著影响（P<0.05）。从图2可看出，对照组和处理组中的浒苔孢子均在96 h内完全萌发，但柴油和原油对其萌发过程表现出不同的影响效应。高浓度柴油分别在48 h和72 h不同程度地抑制了孢子萌发，萌发率分别为对照组的42.70%和87.81%，而低浓度柴油对孢子的影响效应不显著。另外，高浓度原油仅在48 h显著降低了孢子萌发率，而低浓度原油却在24 h提高了孢子萌发率，比对照组增加了299.47%。因此，相比于原油，柴油对浒苔孢子萌发的影响效应更显著，并且高浓度的抑制作用更明显。

图  2  不同石油烃对浒苔孢子萌发的影响

Figure 2.  Effects of different petroleum hydrocarbons on the germination of Ulva prolifera spores

表1的结果表明，不同石油烃处理、胁迫时间及二者交互作用对浒苔幼苗生长均有显著影响（P<0.05）。从图3可以看出，柴油和原油对幼苗的影响效应均为高浓度大于低浓度。对照组和处理组中浒苔幼苗长度均随胁迫时间呈增加的趋势，但不同处理下的幼苗增幅变化呈现出一定差异。其中两浓度柴油处理组均可抑制幼苗生长，在第2 ～ 8 d表现出显著影响。高浓度柴油在培养第8 d时对幼苗抑制效应达到最大，长度仅为对照组的23.69%。而在原油处理组中，仅高浓度组中幼苗的生长在第2 ～ 8 d受到抑制，在培养第8 d时幼苗长度为对照组的39.01%，而低浓度组原油对幼苗影响较小，甚至在第2 ～ 8 d促进了幼苗生长，但均未达到显著性差异。因此对于浒苔幼苗而言，柴油的影响作用同样高于原油。

图  3  不同石油烃对浒苔幼苗生长的影响

Figure 3.  Effects of different petroleum hydrocarbons on the growth of Ulva prolifera seedlings

表2的结果表明，不同石油烃处理、胁迫时间及二者交互作用对浒苔成体生长均有显著影响（P<0.05）。图4表明，柴油和原油在高浓度下对浒苔生长的抑制作用均大于低浓度处理组，甚至使其呈现负增长。对照组中的浒苔生长率随胁迫时间呈现先增加后降低的趋势，而两高浓度处理组则呈现先下降再回升的趋势。与对照组相比，高浓度柴油组中浒苔的生长率在24 ～ 168 h均显著降低，而高浓度原油仅在72 h和168 h降低了浒苔生长率，但两处理组中的浒苔生长率均在72 h达到最低，分别为−2.3%和−1.9%。尽管低浓度柴油组中的浒苔生长率也有所降低，但与对照组的差异不显著。低浓度原油组同样对浒苔生长的影响不显著，甚至在72 ～ 168 h刺激了浒苔生长。因此对浒苔成体生长而言，柴油的影响作用仍然高于原油，并且高浓度的抑制作用更明显。

图  4  不同石油烃对浒苔成体生长的影响

Figure 4.  Effects of different petroleum hydrocarbons on the growth of Ulva prolifera

不同石油烃处理下浒苔体内叶绿素a和类胡萝卜素含量的变化如图5所示。不同石油烃处理以及石油烃与胁迫时间的交互作用对叶绿素a有显著影响（P<0.05），而胁迫时间对叶绿素a影响不显著（P>0.05） （表2）。两种石油烃对叶绿素a的影响效应均为高浓度大于低浓度，并且柴油大于原油。在高浓度柴油胁迫下，浒苔体内的叶绿素a含量在24 ～ 168 h显著低于对照组，并且在168 h时达到最低，为对照组的81.4%。而在低浓度柴油胁迫下，叶绿素a含量虽然有所降低，但与对照组差异不显著。高浓度原油在24 h和72 h降低了叶绿素a的含量，分别为对照组的92.3%和84.3%。而低浓度原油对叶绿素a的影响不显著，甚至高于对照组。

图  5  不同石油烃对浒苔叶绿素a和类胡萝卜素的影响

Figure 5.  Effects of different petroleum hydrocarbons on the chlorophyll a and carotenoids contents of Ulva prolifera

不同石油烃处理、胁迫时间对类胡萝卜素均有显著影响（P<0.05），但二者交互作用对类胡萝卜素影响不显著（P>0.05） （表2）。对照组中的类胡萝卜素含量随时间逐渐增加，而高浓度柴油组中的类胡萝卜素含量却呈现下降的趋势。在高浓度柴油胁迫下，类胡萝卜素含量在24 ～ 168 h显著降低，并且胁迫时间越长，含量降低越显著。在168 h时，浒苔体内类胡萝卜素含量达到最低，为对照组的85.2%。低浓度柴油组中的类胡萝卜素含量呈现波动变化，仅在72 h显著低于对照组，为对照组的93.1%。高浓度原油在72 ～ 168 h降低了类胡萝卜素的含量，分别为对照组的87.3%和89.6%。低浓度原油组中的类胡萝卜素含量也呈现波动变化，但与对照组差异不显著，甚至高于对照组。

不同石油烃处理下浒苔体内可溶性蛋白和可溶性糖含量的变化如图6所示。由表2的结果可知，不同石油烃处理、胁迫时间及二者交互作用对可溶性蛋白均有显著影响（P<0.05）。随培养时间的进行，对照组中浒苔体内的可溶性蛋白含量逐渐增加，而两柴油处理组却表现出不同的趋势，其中高浓度组中的蛋白含量逐渐降低，而低浓度组中的蛋白含量却逐渐增加。柴油浓度越高、胁迫时间越长，浒苔体内可溶性蛋白含量越低。对于原油而言，高浓度处理组中的可溶性蛋白含量呈现先升高再降低的趋势，在72 ～ 168 h显著低于对照组，但降幅低于同浓度柴油。而低浓度原油组中的可溶性蛋白含量呈现逐渐增加的趋势，甚至高于对照组。

图  6  不同石油烃对浒苔可溶性蛋白和可溶性糖的影响

Figure 6.  Effects of different petroleum hydrocarbons on soluble protein and soluble sugar of Ulva prolifera

表2的结果表明，不同石油烃处理、胁迫时间对浒苔体内可溶性糖含量有显著影响（P<0.05），而二者交互作用对其影响不显著（P>0.05）。柴油和原油对浒苔可溶性糖的影响作用均为高浓度大于低浓度，但仅高浓度柴油处理组在72 h和168 h显著降低了浒苔体内可溶性糖的含量，分别为对照组的84.2%和85.5%。

图7和表2是浒苔在石油烃胁迫下体内抗氧化酶活性的变化趋势。不同石油烃处理、胁迫时间及二者交互作用对SOD酶活性均有显著影响（P<0.05）。从图7a可以看出，柴油和原油处理对浒苔体内SOD酶活性的影响均为高浓度大于低浓度。在含油的处理组和无油的对照组中，SOD酶活性随时间均表现出先增加再降低的趋势，但柴油和原油处理组仅在高浓度下对SOD酶活性有显著影响。其中，高浓度柴油对SOD酶的刺激作用最显著，在24 ～ 168 h均增加了浒苔体内SOD酶的活性，并且在72 h时的促进率达到最大，与对照组相比增幅为24.8%；其次为高浓度原油，其在72 h时促进了SOD酶活性，增幅为18.4%。低浓度柴油和原油尽管也在一定程度上刺激了SOD酶的活性，但均与对照组差异不显著。

图  7  不同石油烃对浒苔SOD酶和CAT酶的影响

Figure 7.  Effects of different petroleum hydrocarbons on the SOD and CAT activity of Ulva prolifera

另外，不同石油烃处理、胁迫时间对浒苔体内CAT酶活性有显著影响（P<0.05），而二者交互作用的影响不显著（P>0.05） （表2）。柴油和原油对浒苔CAT酶活性的促进作用，与其浓度呈现明显的正相关关系，但仅高浓度处理下有显著性差异（P<0.05） （图7b）。其中，高浓度柴油在168 h时对 CAT酶活性的促进率达到最大，与对照组相比增幅为210.6%；其次为高浓度原油，其在168 h时对CAT酶活性的促进率比对照组增加191.2%。尽管低浓度柴油和原油也在一定程度上刺激了CAT酶的活性，但均未达到显著性差异水平。

综上可见（表3），低浓度原油仅对浒苔孢子的萌发过程有一定促进作用，对其他阶段的生长发育及各项生理指标均无显著影响。但高浓度原油对浒苔各阶段生长发育及除可溶性糖外的各项生理指标均有影响。低浓度柴油对浒苔孢子的附着、幼苗的生长有抑制作用，但对浒苔成体的生长影响不显著，并且仅对类胡萝卜素和可溶性蛋白这两项生理指标有一定抑制效应。而在高浓度柴油胁迫下，浒苔孢子的附着和萌发、幼苗和成体的生长均受到抑制，并且光合色素、可溶性蛋白、可溶性糖、抗氧化酶等生理指标均出现异常。因此，浒苔不同发育阶段对两种石油烃的敏感度为孢子>幼苗>成体，早期阶段对石油烃更敏感。并且两种石油烃对浒苔的毒性大小为柴油>原油，高浓度>低浓度。

浒苔在不同生长发育阶段对外界石油烃的响应存在明显差异。在早期阶段，对石油烃最为敏感，随着藻体逐渐发育，其耐受能力不断增强。这一结果与目前已有研究报道相符^[13,16-17]。例如，Han等^[13]指出绿藻的幼体或微观阶段对紫外线损伤更敏感。刘青^[16]认为，微藻只能对附着阶段裸露的浒苔孢子/配子产生影响，而萌发期、幼苗期、成体期和死亡期的浒苔均会通过多种途径抑制微藻生长。蔡佳宸等^[17]也认为铜藻腐烂液和培养液对浒苔萌发以及幼苗生长有不同的影响作用。浒苔在不同阶段对外界所表现出的差异性可能与自身的生长特性有关：刚释放的孢子是浒苔生活史中最简单的阶段，仅为裸露的单细胞，无细胞壁保护，大部分生理功能(如蛋白合成和光合作用)还没有完全建立。因此孢子比较脆弱，抵御外界环境能力较弱。而随着浒苔孢子的不断发育，细胞逐渐增多，细胞壁开始形成，其抵御外界环境的能力也不断增强^[18]。

浒苔作为一种适应性较强的大型海藻，其复杂的繁殖方式被认为是黄海绿潮形成的重要原因之一。一些研究报道认为，自然环境中浒苔的快速繁殖主要以孢子/配子繁殖为主，所产生的孢子/配子分散于自然水体中，待条件合适后迅速生长繁殖，引起绿潮灾害^[19]。蔡佳宸等^[17]指出，浒苔微观繁殖体附着和萌发生长阶段是每年绿潮早期形成的重要环节，一旦浒苔微观繁殖体的附着和幼苗的生长受到影响，则可能不仅影响绿潮的早期形成，还会对绿潮的最终规模造成影响。所以石油烃污染对浒苔不同阶段的影响效应值得深入评估。

本研究结果表明，原油对浒苔呈现出“低促高抑”的影响效应。目前这一现象已在浮游植物中被证实^[20]。同时董越等^[12]的研究表明浒苔对原油有一定吸收，并且浒苔可以从海水中通过生物浓缩积累石油组分中的多环芳烃类物质^[21]。一些研究结果显示海洋溢油可能引发大面积藻华，甚至发生多次藻华，且一般发生在溢油发生后几周或几个月内^[22-24]。例如，2010年4月，美国Deepwater Horizon发生重大溢油事件，而MODIS图像显示此次溢油后间隔20 d左右此海域发生藻华^[22-23]；2011年6月，渤海蓬莱溢油历时约3个月，同时在溢油附近海域连续发生了3次微藻藻华^[22]。这可能是因为风化过程、生物分解过程以及有效的溢油处置措施使海水中的石油烃浓度降低^[22,24]。而本文结果证实，在低浓度原油作用下，浒苔孢子可附着萌发、幼苗和成体均可正常生长发育。并且已有报道表明，石油烃经海洋微生物降解，可为藻类生长提供所需的营养盐和小分子有机碳，从而在溢油发生后促进藻体生长^[24-25]。例如，2021年4月，青岛沿岸发生了严重的石油泄漏事件^[26]，而同年夏天黄海暴发了自2007年以来规模最大的一次绿潮^[15]。虽然此次大规模绿潮的发生原因尚不明确，但2021年4月的溢油事件可能为该区域提供了一种促进浒苔藻体生长的环境条件。但总体而言，该溢油事件和溢油后大规模绿潮之间的关系，尚需进一步研究。

相同浓度下柴油对浒苔的毒性作用均高于原油，浒苔各个生长发育阶段均对柴油更敏感。这一结果与Jiang等^[27]、张喆等^[28]的研究结果一致。张喆等^[28]研究表明，原油对斑节对虾不同发育阶段幼体的毒性均小于0^#柴油。石油烃对生物的影响程度取决于石油烃种类、浓度及生物种类。各石油烃类的组成不同，会对不同生物产生不同的影响，甚至对同种生物不同发育阶段和各方面产生的影响也有差异。一般认为，人工炼制的油制品的毒性要远远大于原油。石油烃的毒性主要来源于芳香烃组分及其衍生物（如苯、萘、菲）以及低分子量烷烃及烷基衍生物，且毒性与其含量呈正相关关系^[3]。而0^#柴油WAFs中芳香烃及其取代物、烷烃比例均高于原油^[27]，因而0^#柴油WAFs的毒性更高，对浒苔的抑制效应更强。

本研究中，高浓度柴油对浒苔的毒性作用最显著。在高浓度柴油胁迫下，浒苔各阶段生长发育及光合色素、可溶性组分、抗氧化酶等生理指标均出现异常。石油烃对大型绿藻藻体生长的影响已有相关报道，Liu等^[9]、徐丹等^[11]的研究均表明孔石莼的生长率会随着石油烃浓度的增加而降低。这与本研究结果相符。另外，石油烃还会对浒苔生理特性产生一定毒害，首先会降低其光合色素含量。这与王珊等^[8]、Liu等^[9]、董越等^[12]研究结果一致。其原因可能是，在石油烃作用下，藻类细胞质和叶绿体被瓦解，有关光合作用酶和色素合成酶失活，从而影响光合色素含量。其次，石油烃对浒苔可溶性蛋白的抑制作用大于可溶性糖，并且随胁迫时间而逐渐加强。最后，浒苔SOD与CAT酶的活性在高浓度柴油作用下均显著升高，这与徐丹等^[11]的研究结果相似，即高浓度石油烃胁迫可诱导藻体体内抗氧化酶的合成，从而降低对藻体的毒性，这可能是浒苔为了应对环境中过量石油烃毒害而产生的自我保护机制。

（1） 浒苔在不同生长发育阶段对石油烃的敏感度为孢子>幼苗>成体。随着浒苔的生长发育，其耐受能力不断增强。

（2）两种石油烃对浒苔的毒性效应为柴油>原油，且高浓度>低浓度。在高浓度柴油（12 mg/L）胁迫下，浒苔孢子的附着和萌发、幼苗和成体的生长均受到抑制，并且光合色素、可溶性蛋白、可溶性糖、抗氧化酶等生理指标均出现异常。