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铜藻（Sargassum horneri）为马尾藻科（Sargassaceae）的一年生大型褐藻，广泛分布于西北太平洋暖温带基岩海岸的潮下带[1]。藻体通常营固着生长，其圆柱形气囊可提供浮力，使其能在水下直立生长。铜藻的成株高大且连片分布，形成的场可为多种门类的海洋生物提供避敌、产卵和索饵的场所，具有重要的生态价值[2-3]。定生铜藻受物理或生物因素脱离固着基或者主枝后，可在气囊的浮力作用下变为漂浮状态。漂浮铜藻具有很强的环境适应能力，可在海面生存长达数月，并保持较高的营养生长[4]。漂浮铜藻能为经济鱼类提供优良的产卵场和孵化场，被认为是一种重要的海洋生物资源[5]。然而，漂浮铜藻大规模聚集并登陆，会对近岸水产养殖、滨海旅游、海上交通运输等造成重大影响，被称为“金潮”[6]。
相对于浒苔（Ulva prolifera）绿潮，铜藻“金潮”分布范围更广、影响时间更长，已成为继浒苔绿潮之后，黄东海海域另一跨区域的有害大型藻藻华，并有愈演愈烈之势。2008年浒苔绿潮发生期间，相关学者便观测到浒苔绿潮中夹杂少量漂浮铜藻[7]。2008年后，每年漂浮铜藻均在黄海出现，但未能引起充分重视。2016年底，大量漂浮铜藻登陆苏北浅滩，摧毁大量养殖筏架，造成近5亿元的经济损失[8]。铜藻“金潮”持续至次年春季，与黄海浒苔绿潮混合漂移，使浒苔绿潮的防控变得更加复杂和困难[9]。近几年，漂浮铜藻在苏北浅滩养殖筏架区聚集，在春季与浒苔绿潮并发已成为常态[9]。除此之外，漂浮铜藻在近海聚集甚至登陆的报道还见于韩国西南海岸（包括济州岛海域）、我国台湾北部海域、日本九州等海域[10-12]。
目前，国内外学者已经对定生铜藻群体的分布、生活史，漂浮铜藻的遗传多样性、漂移路径和来源等方面展开了一定的研究[2, 13-15]。漂浮与定生铜藻在形态、生理生化特征等方面存在较大差异。在形态方面，漂浮铜藻相对定生铜藻具有较小的气囊体积和较少的生殖托[16]；在生理特性方面，漂浮铜藻具有更高的生长速率和光合作用热耗散能力[17]，使漂浮铜藻更适应海面环境。这些结果为研究漂浮铜藻群体的形成和暴发机制等奠定了一定的基础。
本文对黄海漂浮铜藻和定生铜藻展开了调查研究，分析不同季节漂浮和定生铜藻的形态特征、生长与繁殖的变化规律，通过分子遗传学手段研究铜藻群体的遗传多样性及其相互关系，为探讨漂浮铜藻来源和暴发机制等提供基础数据和参考资料，也为“金潮”防控提供一定的科学依据。
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2020年11月、2021年4月和2021年6月，分别搭载“向阳红18”“向阳红52”科考船，在南黄海、北黄海和渤海海峡邻近海域采集漂浮铜藻样本15株；2020年11月及2021年4月、6月，在长岛海域采集定生铜藻样本15株（图1，表1）。新鲜样本采集后迅速放入低温箱带回实验室，藻体表面用过滤海水清洗干净，去除表面杂物，保存于−20 ℃冰箱中，以备实验。
图 1 漂浮铜藻和定生铜藻分布区域、采样站点和现场照片
Figure 1. The sampling region, locations and photos of floating and attached Sargassum horneri
地点 采样时间 编号 位置 样品类型 样品数量/株 长岛海域 2020-11 CD 37°55′15″N，120°43′52″E 定生 11 长岛海域 2021-04 CD 37°55′15″N，120°43′52″E 定生 1 长岛海域 2021-06 CD 37°55′15″N，120°43′52″E 定生 3 北黄海 2020-11 HB 37°N ~38°30′N，120°43′E~122°51′E 漂浮 3 南黄海中部 2021-04 H 31°58′19″N~34°N， 122°51′54″E~124°33′36″E 漂浮 4 青岛近岸 2021-06 QD 35°99′N ，120°55′E 漂浮 8 表 1 铜藻采集站点的经纬度和样品信息
Table 1. The latitude and longitude of collecting sites and sample information of S. horneri
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取适量海水于托盘中，将采集的样品铺展其中，用消毒镊子将主体伸展开来，观察其整体形态并拍照记录。测定主枝长度，即固着器至枝叶顶端的最大距离（cm）。用计数器清点分枝数、主侧枝上气囊及生殖托的数量，并计算其平均分布密度[个/（10 cm）]。样本的叶片、气囊和生殖托等相关参数均随机选自主侧枝上最大的样本进行测定，用直尺和游标卡尺测量其长度（cm）、宽度（cm）和直径（cm）等参数[18]。根据气囊长度和直径参数，按照圆柱体体积方程计算气囊的体积[13, 16]。
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利用SPSS 25.0软件分析比较铜藻样品各形态参数，描述性统计值采用平均值（±标准差）表示，通过Shapiro-Wilks方法对数据进行正态性检验，Levene法对数据进行方差齐性检验，采用独立t-检验（independent t-test）比较不同类型铜藻之间的差异性，单因素方差（one-way ANOVA）分析各样品形态差异的显著性并绘图。
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用灭菌刀片切取小块叶片组织（不多于300 mg），放于1.5 mL灭菌离心管中，加裂解液（OMEGA bio-tek, USA），消化过夜，期间用灭菌研磨棒研磨数次，使组织充分裂解。用植物基因组DNA提取试剂盒（OMEGA bio-tek, USA）提取样品基因组DNA，具体步骤参照说明书。
选用5对引物分别PCR扩增ITS、rnl-atp9、rpl5-rps3、cob-cox2和cox3基因片段（表2），其中ITS为核基因，其他为线粒体基因。PCR反应体系均为50 μL，包含Taq PCR Master mix（BBI, 加拿大）25 μL、正反向引物（20 μmol/L）各2.0 μL和模板DNA 2.0 μL，PCR扩增条件参见各参考文献（表2）。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增成功的PCR产物送生工生物工程（上海）有限公司进行正反向测序。
扩增片段 引物名称 引物序列（5′-3′） 参考文献 ITS2 BFF CGATGAAGAACGCAGCGAAATG-CGAT [3,19] 25BR2R TCCTCCGCTTAGTATATGCTTAA rnl-atp9 rnl-atp9-F GGACCAGGAAAACTCGATCCCT [8] rnl-atp9-R TAGACCAATTGTAGCTAGACCAGC rpl5-rps3 rpl5-rps3-F GTTAAAAGAATGCCGCGGAAGTA [8] rpl5-rps3-R TACTTGGAAATACCAAATAGGTC cob-cox2 cob-cox2-F GTTACCTTTTTTAATTACGGGTAT [8] cob-cox2-R AAGAAATAATACCTTCCATAATCGG cox3 CAF4A ATGTTTACTTGGTGRA GRGA [20] CAR4A CCCCACCARTAWATNGTNAG 表 2 本研究所用的分子标记
Table 2. Molecular markers used in this study
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利用MEGA 6.0软件中的ClustalW对核苷酸序列进行对齐和修剪，参数为默认值。针对ITS和cox3基因序列，利用NCBI-BLAST下载同源序列并进行比对，对所得样品进行系统发育研究，根据最大似然距离构建系统发育树，用bootstrap方法检验系统发育树各节点的可信度，各设1000次重复。针对rnl-atp9、rpl5-rps3、cob-cox2和cox3基因序列，利用DNASP 6.12.03软件分别计算各基因的单倍型数量（number of haplotype, H）、分离位点数（number of segregating, S）、核苷酸多样性（nucleotide diversity, PI）以及单倍型多样性（haplotype diversity, HD）[21]。为进一步探讨单倍型之间的亲缘关系、各地理群体单倍型组成和遗传关系等，使用Popart 4.8.4软件，通过中介邻接法（median-joining）构建单倍型网络图进行谱系结构分析，同时根据采样地理位置和样品类别（漂浮或定生）对样品进行分群，利用MEGA 6.0软件计算群体内和群体间遗传距离。
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在本研究中，定生铜藻采集于近岸潮下带礁石或近岸养殖筏架，漂浮铜藻采自南黄海中部大面积漂浮铜藻分布区域以及北黄海零星漂浮铜藻出现海域（图1）。采集的铜藻藻体呈黄褐色，树状，主要结构包括固着器、主枝、分枝、叶片、气囊，部分植株有生殖托（图2）。本研究总共采集铜藻30株，包含15株漂浮铜藻和15株定生铜藻；共测量主、侧枝和气囊300个，平均每株样品测量10个，漂浮铜藻和定生铜藻各测量150个。
图 2 定生铜藻
Figure 2. Attached S. horneri
采集的定生铜藻植株长度为（104.90±55.30）cm，总体枝叶繁茂、分枝众多，尤其是附着于养殖筏架上的铜藻，紧密缠绕于筏架浮球和梗绳等处，难以区分主侧枝。定生铜藻的叶片长度随时间呈现先升后降的趋势，4月最高[（8.90±1.30）cm]，11月[（4.90±1.30）cm]和6月[（5.00±0.70）cm]差异不显著（P>0.05）（图3A）；叶片宽度11月最高[（0.90±0.40）cm]，显著大于4月[（0.60±0.16）cm]和6月[（0.63±0.15）cm]（P<0.05）（图3B）。定生铜藻的气囊形态也存在显著的季节性差异，其长度为4月[（5.73±0.66）cm] >6月[（3.65±0.69）cm] >11月[（3.02±1.02）cm]（P<0.05）（图3C）；直径为11月最低[（0.14±0.02）cm]，明显小于4月[（0.20±0.02）cm]和6月[（0.23±0.03）cm]（P<0.05）（图3D）。
图 3 不同时间段的漂浮铜藻和定生铜藻的比较
Figure 3. Length and width of leaves, length and diameter of gas-filled vesicles were compared between floating and attached S. horneri in different time periods
漂浮铜藻植株长度为（132.90±42.50）cm，叶片长度和宽度随时间变化呈下降趋势，叶片长度11月[（4.82±1.06）cm] >4月[（3.79±0.63）cm] >6月[（2.79±0.87）cm]（P<0.05）；叶片宽度11月[（0.93±0.28）cm]明显高于4月[（0.35±0.12）cm]和6月[（0.28±0.12）cm]（P<0.05）。漂浮铜藻气囊的长度和直径变化与其叶片相似，长度6月最低[（1.64±0.68）cm]，明显小于4月[（2.55±0.70）cm]和11月[（2.79±0.99）cm]（P<0.05）；直径为11月[（0.16±0.03）cm] >4月[（0.13±0.03）cm] >6月[（0.11±0.02）cm]（P<0.05）。
相比较而言，同时期不同地点的铜藻样本的形态结构有不同的变化规律，表现为11月北黄海（HB）漂浮铜藻和长岛（CD）定生铜藻形态差异不大；4月长岛定生铜藻叶片和气囊大小显著高于南黄海中部（H）漂浮铜藻；6月的变化规律与4月相似，长岛定生铜藻叶片和气囊大小显著高于青岛近岸（QD）漂浮铜藻（P<0.05）。研究结果表明，漂浮和定生铜藻植株形态呈明显的季节变化，11月铜藻植株相对繁茂，叶片“锯齿”状程度高，漂浮和定生铜藻叶片和气囊形态差别不大。11月以后，漂浮和定生铜藻形态分化明显，4－6月漂浮铜藻叶片和气囊大小持续下降，叶片的“锯齿”状程度低，而定生铜藻叶片和气囊可继续生长至4月，随后呈下降趋势（图4）。
图 4 不同时间段的漂浮铜藻和定生铜藻叶片（A-F）、气囊（G-L）形态比较
Figure 4. Morphological comparisons of leaves (A-F) and gas-filled vesicles (G-L) of the floating and attached S. horneri in different time periods
气囊主要分布在铜藻藻体的中部和顶部，气囊数量随时间变化呈现先上升后下降的趋势，4月各主侧枝气囊数量达到最大，4－6月，漂浮铜藻和定生铜藻的气囊数量逐渐减少。定生铜藻每根次生分枝的气囊个数[（32±85）个/（10 cm）]明显少于漂浮铜藻[（63±20）个/（10 cm）]（图5A）。漂浮铜藻的气囊体积随时间变化呈下降趋势，定生铜藻的气囊体积随时间变化则呈逐渐升高的趋势（P<0.05）（图5B）。
图 5 漂浮铜藻和定生铜藻的气囊数量（A）和体积（B）统计
Figure 5. Abundance (A) and volume (B) of gas-filled vesicles of the floating and attached S. horneri
4月以后铜藻开始成熟，出现生殖托，漂浮铜藻的生殖托数量远不及定生铜藻，且生殖托比定生铜藻的更为细小（图6）。漂浮铜藻平均每10 cm含生殖托1个，定生铜藻含有15个；漂浮铜藻的生殖托长度为（2.14±0.91）cm，定生铜藻的生殖托长度为（4.01±1.41）cm。
图 6 漂浮和定生铜藻 6 月生殖托数量统计（A）和形态比较（B-C）
Figure 6. Abundance(A) and morphological comparison (B-C) of receptacles between the floating and attached S. horneri in June
结果显示，铜藻样本形态（包括叶片和气囊大小）存在明显的季节性变化。11月定生和漂浮铜藻形态差异不明显，4－6月两者形态分化显著，定生铜藻有逐渐生长的趋势，而漂浮铜藻叶片和气囊细小萎缩、细胞色素含量下降（图4），说明铜藻在脱离定生环境进行漂浮生活后，叶片和气囊的形态特征发生了适应性变化。6月漂浮铜藻的生殖托数量明显不及定生铜藻，且较定生铜藻细短并发黄萎缩（图6），这与前期研究结果一致。对山东半岛、浙江沿岸等地漂浮和定生铜藻的调查研究显示，铜藻在脱离固着器营漂浮生活之后有性生殖能力下降[13, 16-17]。遥感监测发现，北黄海海域常于秋季（10－11月）开始出现漂浮铜藻[15, 22]。本文的形态观测结果表明，秋季漂浮铜藻出现以后，随着时间的推移，定生铜藻与漂浮铜藻之间的形态差异越发明显，这种形态变化的差异，进一步验证了前期推测，间接证实了北黄海定生铜藻对秋、冬季漂浮铜藻“金潮”的贡献[15, 22]。
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不同个体之间等位基因特定位点上的单碱基序列差异，包括单个碱基置换（转换和颠换）、缺失和插入等，是基因多态性的一种形式，又称为单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）[23]。本研究采集的铜藻样品中单核苷酸多态性（SNP）是其主要的遗传多样性表现形式。
本研究共扩增筛选了5组分子标记，其中ITS2扩增片段长度为628 bp，有2个多态性位点，一个位点存在纯合子TT、CC和杂合子TC三种基因型，另一位点仅存在纯合子TT和杂合子TC两种基因型。综合2个位点，30个样本共发现CC/TT、TC/TT、TC/TC、CC/TC、TT/TT五种基因型，其中TC/TT基因型出现频率最高，达60.00%，其次为纯合子CC/TT和TT/TT（各占13.30%）。
线粒体基因中，cox3扩增片段长度为492 bp，样品序列100%一致，未检测到多态性位点，其余三个基因片段共发现9个SNP（single nucleotide polymorphism）位点。rnl-atp9片段长度为416 bp，有2个分离位点，rpl5-rps3片段长度为855 bp，有6个分离位点，cob-cox2片段长度为705 bp，有2个分离位点（表3）。9个位点中，6个（表4）为碱基转换（transition），2个为碱基颠换（transversion），1个为碱基插入缺失型（indel）。
分子标记 序列长度/bp 序列数量 分离位点数 单倍型数量 核苷酸多样性 单倍型多样性 rnl-atp9 416 30 2 3 0.00190±0.00086 0.515±0.087 rpl5-rps3 855 30 6 5 0.00125±0.00072 0.492±0.100 cob-cox2 705 28 2 3 0.00093±0.00052 0.362±0.100 cox3 492 30 0 1 0 0 合计a 1976 28 9 5 0.00125±0.00037 0.563±0.097 注：a为仅统计 3 个有多样性的线粒体基因 表 3 铜藻不同分子标记的遗传多样性参数
Table 3. Genetic diversity parameters of different molecular markers in S. horneri
单倍型 rnl-atp9 rpl5-rps3 cob-cox2 163a 271a 19c 28b 267a 582a 843b 21a 579a HAP1 A T − G T T A T C HAP2 G C A G T C C C T HAP3 A T − G C T A T T HAP4 G T − G T C C C T HAP5 G T − C T C A C T 注：a为碱基转换，b为碱基颠换，c为碱基插入缺失，−为碱基缺失 表 4 基于三个线粒体基因的单倍型分离位点碱基组成
Table 4. Nucleotide composition of the haplotypes based on the three mitochondrial genes
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除偶尔有零星其他马尾藻属种类（如海黍子Sargassum muticum、羊栖菜Sargassum fusiforme）漂浮外，取样范围内采集的漂浮马尾藻样本属于同一类群，均为马尾藻属的铜藻（图7）。
图 7 基于 ITS（A）和 cox3（B）序列构建的系统进化树（羊栖菜S. fusiforme、鼠尾藻S. thunbergii和线形马尾藻S. filicinum作为外类群）
Figure 7. Phylogenetic trees based on partial ITS and cox3 sequences (S. fusiforme, S. thunbergii and S. filicinum were outgroups)
基于线粒体基因序列构建的铜藻单倍型网络图（图8）显示，rnl-atp9和cob-cox2片段均可分为3个单倍型，前者单倍型2（HAP2）较为常见，占样品总数的66.67%，后者单倍型3（HAP3）较常见，占样品总数的78.57%（图8A、图8C）；rpl-rps3片段可分为5个单倍型，其中单倍型1和3（HAP1、HAP3）较为常见，占样品总数的86.67%（图8B）。综合三个线粒体基因片段进行单倍型分析，结果显示9个分离位点仅形成5个单倍型，其中单倍型3占比最高，为64.29%，单倍型1其次，为17.86%，单倍型2、4、5占比较低（3.57% ～ 7.14%，图8D），长岛定生样本的单倍型数量（4个）明显高于漂浮样本（1～3个）。
图 8 基于 rnl-atp9、rpl5-rps3、cob-cox2 序列和综合三段基因序列构建的铜藻样品单倍型网络
Figure 8. Haplotype networks of S. horneri samples based on rnl-atp9, rpl5-rps3, cob-cox2 and combined three gene sequences
综合ITS和线粒体基因序列，计算群体内和群体间遗传距离（表5）。按采样地理位置将样本分为黄渤海（HB）、南黄海中部（H）、青岛近岸（QD）和长岛海域（CD）四个群体，群体内遗传距离为0.0000～0.0019，群体间为0.0003～0.0016，群体间遗传距离没有明显高于群体内遗传距离，各群体间遗传分化不明显。进一步将HB、H和QD合并为漂浮群体（FL），与定生群体（CD）相比，群体内（包括FL和CD）遗传距离为0.0007～0.0011，而群体间遗传距离（0.0009）在群体内遗传距离变化范围内，说明漂浮与定生群体的遗传分化也不明显。同时，以不同的采样时间（2020年和2021年）区分铜藻样本，对比发现，采集于同一年份的群体内遗传距离（如：HB群体内遗传距离为0.0019）往往高于不同年份的群体间遗传距离（如：HB与H、QD的群体间遗传距离分别为0.0016和0.0012）。
HB H QD CD FL HB 0.0019 − − − − H 0.0016 0.0000 − − − QD 0.0012 0.0003 0.0004 − − CD 0.0015 0.0007 0.0008 0.0011 − FL − − − 0.0009 0.0007 注：黑体为群体内遗传距离，编号见表 1，FL 为综合 HB、H 和 QD 三个群体 表 5 铜藻群体内和群体间的遗传距离
Table 5. The intrapopulation and interpopulation genetic distances of S. horneri samples
上述遗传多样性分析结果表明，这些漂浮铜藻样本内的遗传多样性水平较低，这与众多的前期研究结果相似。例如：蔡一凡等[24]对我国浙江沿海铜藻群体采集的样品进行5.8S rDNA-ITS序列分析，结果表明仅有1个变异位点，说明群体遗传多样性较低；吕芳等[3]发现，2016年和2017年中国近海漂浮和定生铜藻的cox I序列完全一致，ITS序列只存在2个变异位点，而同一地理种群相同年份和不同年份的群体间均没有显著的遗传差异。
早期，Hu等[25]根据cox3和rbcL基因序列分析即指出太平洋西北沿岸存在多个遗传差异显著的定生铜藻种群，中国沿岸以株系I（Clade I）为主，与日本沿岸定生种群明显不同。近年来，众多学者多次对黄东海漂浮铜藻进行遗传分析，均发现其与中国群体遗传关系较近[8, 10]，推测其可能来自中国沿岸，这与遥感监测、粒子追踪和数值模拟等研究结果也一致[14]。本研究结果表明，黄渤海漂浮铜藻属于中国株系，与日、韩定生铜藻存在一定的遗传差异（数据未显示）；不同地理群体间以及不同类型群体间和群体内遗传距离差异不显著，暗示该海域漂浮和定生铜藻可能来自相同的遗传群体，这为黄海漂浮铜藻溯源提供了一定的基础数据。
目前，更多的研究关注于黄东海漂浮铜藻是否起源于中国沿岸某个定生群体。遥感监测和现场调查发现铜藻漂移路径季节性和年际变化较大，可能存在多个来源[14-15, 22]。利用高突变率线粒体基因或微卫星分子标记对漂浮和定生铜藻群体进行遗传结构分析，发现漂浮铜藻除了与韩国沿岸定生种群存在明显的遗传分化之外，与中国浙江、山东和辽宁等地的定生群体也存在一定程度的遗传差异[21]，同时指出不同年份的漂浮铜藻而非不同地理群体会有一定的遗传波动，表明漂浮铜藻遗传性质的不稳定性，可能有多个来源[21]。本研究利用多态性线粒体基因片段进行研究分析，结果表明黄渤海漂浮和定生铜藻单倍型数量不高，以2个单倍型为主，其余中间过渡态单倍型出现频率较低，这个结果与Liu等[8]的研究结果相似，大部分漂浮铜藻的单倍型能在定生群体中找到；不同地理群体间的遗传距离不大，甚至小于群体内遗传距离，说明这些漂浮和定生群体或来自相同种群。Byeon等[10]的研究亦发现同一年份的漂浮铜藻群体内遗传差异往往高于不同年份的群体间遗传差异，微卫星分子标记的扩增显示几乎所有漂浮铜藻群体杂合子出现频率远高于Hardy–Weinberg平衡定律所预期的频率[10]，表明漂浮铜藻并非具有稳定遗传特性的独立群体，部分铜藻在人为或自然干扰下形成漂浮群体，受起始漂浮个体数量和随机性等因素影响，漂浮铜藻群体易产生遗传漂变（genetic drift）。
综上，漂浮铜藻的来源及暴发机制目前尚没有明确的定论，本研究对黄渤海漂浮铜藻和定生铜藻开展形态特征和遗传多样性调查研究，为探讨漂浮铜藻来源提供数据支撑。同时，本研究尚有一定的不足之处，今后需要加强生态观测，进一步扩大定生铜藻样品数，利用更高分辨率的分子标记研究不同定生群体是否存在稳定显著的遗传分化，研究漂浮铜藻群体结构和漂移路径的年际变化及其规律，长期追踪铜藻漂浮过程和漂移路径，并综合其他研究手段，如遥感观测、现场调查、数值模拟等，可为铜藻溯源分析等提供更充分的证据。
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（1）调查海域内铜藻样本形态（包括植株、叶片、气囊和生殖托等）有明显的季节性变化，且定生铜藻与漂浮铜藻的变化规律不一致。秋季（11月）定生和漂浮铜藻形态差异不大，随着时间的推移，两者形态分化明显，形态差异在春季最大，然后漂浮铜藻呈快速衰败趋势，而定生铜藻衰败趋势不如漂浮铜藻明显。结合遥感技术方法和现场调查数据，长岛海域定生铜藻对秋、冬季黄海漂浮铜藻群体有一定的贡献。
（2）分子遗传学研究表明，调查海域漂浮和定生铜藻的遗传多样性水平很低，且不同地理群体、不同年份样本之间的遗传差异不显著，推测该海域漂浮和定生铜藻来自相同的遗传群体。单倍型网络谱系分析显示，本研究铜藻样本以2种单倍型为主，其他过渡态单倍型出现的频率较低，表明黄海漂浮和定生铜藻可能由少数独立群体经近代混合交流而来。
黄海铜藻形态特征和遗传多样性研究
Study on the morphology and genetic diversity of Sargassum horneri in the Yellow Sea
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摘要: 为研究黄海漂浮铜藻的来源以及藻体特征，在北黄海、南黄海和青岛近岸采集漂浮铜藻，并对长岛海域定生铜藻开展调查研究。结果表明，漂浮和定生铜藻的植株形态呈现不同的季节性变化，11月两者的叶片和气囊形态差别不大，4－6月形态分化明显，表现为定生铜藻的叶片和气囊继续生长，而漂浮铜藻呈衰败趋势；漂浮铜藻的生殖托数量远低于定生铜藻，且较细短。同时，本文利用核基因（ITS2）和线粒体基因片段（cox3、rnl-atp9、rpl5-rps3和cob-cox2）研究铜藻样本的遗传多样性，结果显示，ITS2序列共发现2个多态性位点、5种基因型，线粒体基因片段共发现9个多态性位点、5个单倍型；不同地理群体间以及漂浮和定生群体间的遗传距离与群体内遗传距离差异不显著，表明该海域漂浮和定生铜藻可能来自相同的遗传群体。Abstract: In order to study the origin and characteristic of the floating Sargassum horneri in the Yellow Sea, floating S. horneri samples were collected from the northern, southern Yellow Sea and the coastal water of Qingdao. The attached samples on the aquaculture rafts along the coast of Changdao were also investigated seasonally. The study showed that the plant morphology of floating and attached S. horneri had distinct seasonal patterns. In November, there was no significant difference of the leaves and gas-filled vesicles between the floating and attached samples. Form April to June, they had obvious morphological differentiation, such as leaves and vesicles of the attached S. horneri were growing while those of the floating samples tended to decrease. The receptacles of the floating S. horneri was obviously less and slimmer than that of the attached ones. Meanwhile, one nuclear (ITS2) and 4 mitchondrial gene fragments (cox3, rnl-atp9, rpl5-rps3, cob-cox2) were selected to investigate the genetic diversity among these S. horneri samples in this study. The results showed that there were 2 polymorphic loci and 5 genotypes detected from ITS2 sequences, 9 polymorphic loci and 5 haplotypes based on the mitchondrial genes in these samples. The inter-population genetic distances among the geographic samples and between floating and attached samples were not significantly different with those intra-population genetic distances, which suggested these samples could be from the same genetic population.
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Key words:
- Sargassum horneri /
- golden tide /
- morphological features /
- genetic diversity /
- haplotype
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图 1 漂浮铜藻和定生铜藻分布区域、采样站点和现场照片
Figure 1. The sampling region, locations and photos of floating and attached Sargassum horneri
图 3 不同时间段的漂浮铜藻和定生铜藻的比较
Figure 3. Length and width of leaves, length and diameter of gas-filled vesicles were compared between floating and attached S. horneri in different time periods
图 4 不同时间段的漂浮铜藻和定生铜藻叶片（A-F）、气囊（G-L）形态比较
Figure 4. Morphological comparisons of leaves (A-F) and gas-filled vesicles (G-L) of the floating and attached S. horneri in different time periods
图 5 漂浮铜藻和定生铜藻的气囊数量（A）和体积（B）统计
Figure 5. Abundance (A) and volume (B) of gas-filled vesicles of the floating and attached S. horneri
图 6 漂浮和定生铜藻 6 月生殖托数量统计（A）和形态比较（B-C）
Figure 6. Abundance(A) and morphological comparison (B-C) of receptacles between the floating and attached S. horneri in June
图 7 基于 ITS（A）和 cox3（B）序列构建的系统进化树（羊栖菜S. fusiforme、鼠尾藻S. thunbergii和线形马尾藻S. filicinum作为外类群）
Figure 7. Phylogenetic trees based on partial ITS and cox3 sequences (S. fusiforme, S. thunbergii and S. filicinum were outgroups)
图 8 基于 rnl-atp9、rpl5-rps3、cob-cox2 序列和综合三段基因序列构建的铜藻样品单倍型网络
Figure 8. Haplotype networks of S. horneri samples based on rnl-atp9, rpl5-rps3, cob-cox2 and combined three gene sequences
表 1 铜藻采集站点的经纬度和样品信息
Table 1. The latitude and longitude of collecting sites and sample information of S. horneri
地点 采样时间 编号 位置 样品类型 样品数量/株 长岛海域 2020-11 CD 37°55′15″N，120°43′52″E 定生 11 长岛海域 2021-04 CD 37°55′15″N，120°43′52″E 定生 1 长岛海域 2021-06 CD 37°55′15″N，120°43′52″E 定生 3 北黄海 2020-11 HB 37°N ~38°30′N，120°43′E~122°51′E 漂浮 3 南黄海中部 2021-04 H 31°58′19″N~34°N， 122°51′54″E~124°33′36″E 漂浮 4 青岛近岸 2021-06 QD 35°99′N ，120°55′E 漂浮 8 
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表 2 本研究所用的分子标记
Table 2. Molecular markers used in this study
扩增片段 引物名称 引物序列（5′-3′） 参考文献 ITS2 BFF CGATGAAGAACGCAGCGAAATG-CGAT [3,19] 25BR2R TCCTCCGCTTAGTATATGCTTAA rnl-atp9 rnl-atp9-F GGACCAGGAAAACTCGATCCCT [8] rnl-atp9-R TAGACCAATTGTAGCTAGACCAGC rpl5-rps3 rpl5-rps3-F GTTAAAAGAATGCCGCGGAAGTA [8] rpl5-rps3-R TACTTGGAAATACCAAATAGGTC cob-cox2 cob-cox2-F GTTACCTTTTTTAATTACGGGTAT [8] cob-cox2-R AAGAAATAATACCTTCCATAATCGG cox3 CAF4A ATGTTTACTTGGTGRA GRGA [20] CAR4A CCCCACCARTAWATNGTNAG
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表 3 铜藻不同分子标记的遗传多样性参数
Table 3. Genetic diversity parameters of different molecular markers in S. horneri
分子标记 序列长度/bp 序列数量 分离位点数 单倍型数量 核苷酸多样性 单倍型多样性 rnl-atp9 416 30 2 3 0.00190±0.00086 0.515±0.087 rpl5-rps3 855 30 6 5 0.00125±0.00072 0.492±0.100 cob-cox2 705 28 2 3 0.00093±0.00052 0.362±0.100 cox3 492 30 0 1 0 0 合计a 1976 28 9 5 0.00125±0.00037 0.563±0.097 注：a为仅统计 3 个有多样性的线粒体基因
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表 4 基于三个线粒体基因的单倍型分离位点碱基组成
Table 4. Nucleotide composition of the haplotypes based on the three mitochondrial genes
单倍型 rnl-atp9 rpl5-rps3 cob-cox2 163a 271a 19c 28b 267a 582a 843b 21a 579a HAP1 A T − G T T A T C HAP2 G C A G T C C C T HAP3 A T − G C T A T T HAP4 G T − G T C C C T HAP5 G T − C T C A C T 注：a为碱基转换，b为碱基颠换，c为碱基插入缺失，−为碱基缺失
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表 5 铜藻群体内和群体间的遗传距离
Table 5. The intrapopulation and interpopulation genetic distances of S. horneri samples
HB H QD CD FL HB 0.0019 − − − − H 0.0016 0.0000 − − − QD 0.0012 0.0003 0.0004 − − CD 0.0015 0.0007 0.0008 0.0011 − FL − − − 0.0009 0.0007 注：黑体为群体内遗传距离，编号见表 1，FL 为综合 HB、H 和 QD 三个群体
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