海洋占地球总表面积的71%，工业革命以后，人类活动排放的CO₂约有40%被海洋吸收^[1-2]。目前已知的海洋储碳机制主要包括生物泵、微型生物碳泵、溶解泵和碳酸盐泵，其中生物泵的碳输出通量通常占到初级生产的15%到20%^[3-4]。硅藻是海洋中分布最广、种类最多的浮游植物，占全球初级生产的20%^[5-6]。由于硅藻具有硅壳，而硅的密度大于水，因此，硅藻往往比其他浮游植物下沉得更快，对碳沉降的贡献也比其他浮游植物大^[7-8]。据估算，海洋硅藻沉降的输出占生物泵颗粒有机碳沉降输出的40%，是海洋生物泵的重要组成部分^[5-6]。因此，硅藻的沉降速率对生物泵的碳汇效率有重要影响。

除羽纹硅藻纲的部分种类外，绝大部分浮游硅藻不具备运动能力。在不考虑外部影响的情况下，硅藻的沉降速率是重力和浮力相互作用的结果^[9]。根据浮力公式，物体的体积越大，其所受的浮力也越大，因此，硅藻的粒径被认为是影响其沉降速率的关键因素^{[7, 10]}。由于硅的密度远大于海水密度，硅的相对含量也是决定硅藻沉降速率的重要因素^[11]。除硅壳外，蛋白质、多糖、脂肪，细胞液中离子的浓度和组成等细胞内含物也有可能对硅藻细胞的密度产生影响。例如，蛋白质、多糖密度大于海水密度，而脂肪密度小于海水密度。通过改变内含物中这些物质的组成和比例或者通过代谢作用与周围环境进行物质交换，部分硅藻可以改变细胞内含物的密度对自身沉降速率进行调节^[12-13]。

目前，硅藻沉降速率多以SETCOL沉降柱法测定，以原位测定为主^[14-15]。由于野外实验条件的限制以及自然环境中硅藻的生长周期存在差异，测得的往往是处于不同生长阶段的硅藻平均沉降速率。不同种硅藻在相同生长阶段沉降速率的测定和比较，无法在野外进行，硅壳和细胞内含物对其沉降速率影响差异的研究仍不充分。本研究通过SETCOL沉降柱法测定分离自北部湾近岸的17种常见硅藻（处于指数生长期）的活细胞、硅壳（只有硅藻外壳）和热致死细胞（细胞内含物和硅壳完整，但不具有代谢活性）的沉降速率，比较三者沉降速率的差异，分析硅壳、细胞活性、细胞内含物对不同种类硅藻沉降速率的影响，有助于了解海洋硅藻群落结构的变化对生物泵效率的影响，加深对硅藻沉降在海洋碳汇中作用的认识。

1   材料与方法

1.1   藻种来源及培养条件

本研究所用17种硅藻为冰河拟星杆藻 （Asterionella glacialis） 、布氏双尾藻 （Ditylum brightwellii） 、锤状中鼓藻 （Bellerochea malleus） 、簇生菱形藻 （Nitzschia fasciculata） 、短角弯角藻 （Eucampia zodiacus） 、哈德掌状藻 （Palmeria hardmaniana） 、具边线形圆筛藻 （Coscinodiscus marginato-lineatus） 、菱形海线藻 （Thalassionema nitzschioides） 、牟氏角毛藻 （Chaetoceros muelleri） 、盘形菱形藻 （Nitzschia tryblionella） 、日本星杆藻（Asterionella japonica）、斜纹藻 （Pleurosigma sp.） 、星脐圆筛藻（Coscinodiscus asteromphalus） 、旋链角毛藻 （Chaetoceros curvisetus） 、圆海链藻 （Thalassiosira rotula） 、掌状冠盖藻 （Stephanopyxis palmeriana） 、中肋骨条藻 （Skeletonema costatum） ，均由广西科学院北部湾海洋微藻种质资源库提供，以f/2培养基进行培养^[16-17]。培养温度为20 ℃，盐度为30，光照强度设置为4000 Lux，光暗比为12 h∶12 h，培养条件与保种条件一致。

1.2   实验设计

待硅藻细胞培养至指数生长期后，将藻液分成三份：一份直接进行沉降速率测定；一份通过热致死处理后进行沉降速率测定；一份通过酸处理获得硅藻壳后进行沉降速率测定。沉降速率的测定方法为SETCOL沉降柱法。每种硅藻的每个组别重复测定3次。

1.3   沉降速率的测定

测定沉降速率前，通过摇匀以及移液枪吹散的方法使大部分聚集的硅藻转换成单细胞。硅藻活细胞、热致死细胞和硅壳的沉降速率均按Bienfang^[14]的描述用SETCOL沉降法进行测定，实验装置如图1所示，将待测样品缓慢倒入SETCOL沉降柱中，静置30～120 min后依次从上、中、下层出水口取出亚样品用于沉降速率（$ \varphi $）的计算。沉降速率计算公式为：

图  1  SETCOL沉降柱

Fig.  1  SETCOL sedimentation method sedimentation column

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式中：$ {B}_{s} $为总下沉生物量；$ {B}_{t} $为沉降柱内平均总生物量；L为沉降柱长度；t为沉降时间。本实验使用SETCOL沉降柱的体积为350 mL，柱子的高度和直径分别为50 cm和3 cm。

1.4   热致死细胞的制备

取10 mL藻液于50 mL离心管中，用45 ℃水浴加热5～10 min。不同藻种水浴的加热时间通过预实验确定^[18]。热致死细胞失去细胞活性的判断标准为：（1）水浴加热后，在显微镜下观察，细胞内含物无渗漏；（2）水浴加热后将细胞重新接入新的培养液中，培养48 h后，细胞密度无增加。

1.5   硅壳的制备

取10 mL藻液按1∶1的比例加入浓盐酸，用封瓶膜包住试管口后转移至100 ℃的水浴锅中加热20 min。冷却至室温后，吸取上层酸液，以蒸馏水清洗沉降的硅壳6次，取样镜检硅壳完整性^[19]。含硅壳的样品稀释到1 L的人工培养基中，用于沉降实验。

1.6   硅藻细胞密度、体积

硅藻用5%的鲁哥氏液固定，倒置显微镜下计数细胞密度。根据Sun等^[20]的方法，通过浮游生物计数分析智能鉴定系统测量细胞各轴长后，按近似的几何模型计算硅藻细胞的体积（V）。根据等效体积将硅藻转化成标准球形，求出硅藻细胞的标准球形直径（ESD）^[21]。等效球形直径的计算公式为：

1.7   数据处理

同种硅藻活细胞、热致死细胞和硅壳沉降速率之间的差异以One-way ANOVA进行检验。对不同种类硅藻细胞大小和沉降速率之间的关系，以及不同种类硅藻的活细胞、热致死细胞和硅壳三者的沉降速率进行回归分析，统计分析在SPSS Statistics 26（IBM）中进行，置信区间设为95%。硅藻沉降速率的离散程度用变异系数 （ CV ） 来表示：

式中：$ \mathrm{\sigma } $是标准差；$ \bar{x} $是平均值。

2   结果与讨论

2.1   硅藻细胞大小

实验所用17种硅藻的ESD为11.49～427.21 µm，细胞体积为99.30～5.10$ \times $10⁶ µm³。其中，粒径最大的是哈德掌状藻，ESD为427.21 µm，细胞体积为5.10$ \times $10⁶ µm³；而粒径最小的旋链角毛藻粒径仅为11.49 µm，体积为99.30 µm³。17种硅藻中，粒径>100 µm的大型硅藻有哈德掌状藻、星脐圆筛藻和掌状冠盖藻（表1）。

表  1  不同硅藻细胞的几何参数（平均值±标准差）

Tab.  1  Geometric parameters of different diatoms (mean ± standard deviation)

中文名称	a轴/µm	b轴/µm	c轴/µm	体积/µm3	等效球形直径/µm
冰河拟星杆藻	8.12 ± 0.97	7.37 ± 0.99	—	440.93 ± 170.17	18.89 ± 2.20
布氏双尾藻	104.61 ± 23.56	21.79 ± 3.06	—	2.15$ \times $104 ± 4.85$ \times $103	69.01 ± 5.32
锤状中鼓藻	41.05 ± 4.27	25.68 ± 2.35	—	1.17$ \times $104 ± 2.44$ \times $103	56.37 ± 3.97
簇生菱形藻	41.56 ± 4.25	8.06 ± 1.3	5.8 ± 0.87	970.63 ± 277.25	24.57 ± 2.35
短角弯角藻	38.36 ± 4.03	32.74 ± 7.24	16.16 ± 3.53	1.59$ \times $104 ± 7.20$ \times $103	62.45 ± 9.35
哈德掌状藻	304.45 ± 9.6	261.99 ± 32.02	166.94 ± 11.3	5.10$ \times $106 ± 9.37$ \times $105	427.21 ± 26.58
具边线型圆筛藻	39.56 ± 5.4	—	20.56 ± 3.4	2.52$ \times $104 ± 8.79$ \times $103	72.82 ± 8.33
菱形海线藻	22.36 ± 2.73	6.96 ± 1.29	—	1.08$ \times $103 ± 451.96	25.49 ± 3.39
牟氏角毛藻	8.42 ± 1	6.76 ± 0.78	4.92 ± 0.67	220.08 ± 65.84	14.98 ± 1.47
盘形菱形藻	9.72 ± 1.22	7.09 ± 0.71	—	244.15 ± 56.11	15.51 ± 1.36
日本星杆藻	13.71 ± 1.87	18.02 ± 2.51	—	4.45$ \times $103 ± 778.89	40.82 ± 3.77
斜纹藻	105.74 ± 7.76	22.72 ± 1.3	14.84 ± 2.01	1.78$ \times $104 ± 2.89$ \times $103	64.82 ± 3.55
星脐圆筛藻	101.41 ± 4.34	—	59.27 ± 10.63	4.79$ \times $105 ± 5.10$ \times $104	194.11 ± 6.77
旋链角毛藻	6.62 ± 1.22	5.09 ± 0.83	3.75 ± 0.62	99.30 ± 30.68	11.49 ± 1.17
圆海链藻	17.32 ± 1.53	—	13.48 ± 1.38	3.17$ \times $103 ± 762.48	36.47 ± 2.81
掌状冠盖藻	47.51 ± 5.83	57.77 ± 3.35	—	7.41$ \times $104 ± 1.75$ \times $104	104.20 ± 8.22
中肋骨条藻	8 ± 1.15	6.46 ± 0.74	—	1.00$ \times $103 ± 326.16	24.84 ± 2.55
注：17种硅藻a、b、c各轴的定义均参照SUN等[20]的几何模型，通过测量20个细胞获得

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2.2   沉降速率

硅藻活细胞的平均沉降速率为0.0110～0.9185 $ \mathrm{c}\mathrm{m}/\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n} $，其中，哈德掌状藻平均沉降速率最大（0.9185 $ \mathrm{c}\mathrm{m}/\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n} $）、旋链角毛藻平均沉降速率最小（0.0110 $ \mathrm{c}\mathrm{m}/\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n} $）。热致死细胞的平均沉降速率为0.0078～0.8715 $ \mathrm{c}\mathrm{m}/\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n} $，其中，哈德掌状藻热致死细胞的平均沉降速率最大（0.8715 $ \mathrm{c}\mathrm{m}/\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n} $）、牟氏角毛藻热致死细胞的平均沉降速率最小（0.0078 $ \mathrm{c}\mathrm{m}/\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n} $）。硅壳的平均沉降速率为0.0063～0.2966 $ \mathrm{c}\mathrm{m}/\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n} $，其中，哈德掌状藻硅壳的平均沉降速率最大（0.2966 $ \mathrm{c}\mathrm{m}/\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n} $）、牟氏角毛藻硅壳的沉降速率最小（0.0063 $ \mathrm{c}\mathrm{m}/\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n} $）（图2）。

图  2  硅藻活细胞、热致死细胞及硅壳的沉降速率

Fig.  2  The sinking rate of live diatom, heat-kill cells and diatom shell

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冰河拟星杆藻、菱形海线藻、圆海链藻、锤状中鼓藻、牟氏角毛藻和哈德掌状藻活细胞的沉降速率显著高于其热致死细胞和硅壳的沉降速率（p<0.05）。星脐圆筛藻、具边线形圆筛藻和斜纹藻硅壳的沉降速率显著高于其活细胞的沉降速率（p<0.05）。布氏双尾藻、簇生菱形藻、盘形菱形藻、旋链角毛藻、掌状冠盖藻和中肋骨条藻的活细胞、热致死细胞、硅壳的沉降速率三者之间无显著差异（p>0.05，图2）。

本研究的17种硅藻中，活细胞、热致死细胞和硅壳的沉降速率变异系数均小于0.4的种类占75%以上。其余少数硅藻活细胞和硅壳的沉降速率变异系数大于0.4，热致死细胞沉降速率变异系数小于0.4，且除盘形菱形藻外，活细胞的沉降速率变异系数均大于硅壳和热致死细胞（图3）。

图  3  硅藻活细胞、热致死细胞和硅壳的沉降速率的变异系数

Fig.  3  Variation coefficients of sinking rate of live diatom, heat-kill cells and diatom shell

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2.3   硅藻活细胞、热致死细胞和硅壳的沉降速率之间的关系

对硅藻正常代谢活细胞、热致死细胞和硅壳的沉降速率进行回归分析，结果表明，正常代谢的硅藻活细胞的沉降速率与热致死细胞的沉降速率存在极显著的正相关关系（p<0.01）而与硅壳的沉降速率无显著的相关关系（p>0.05）。热致死细胞的沉降速率可以解释36.25%的活细胞的沉降速率的变化。热致死细胞的沉降速率与硅壳的沉降速率之间也无显著的相关关系（p>0.05, 图4）。

图  4  硅藻活细胞、热致死细胞和硅壳的沉降速率之间的关系

Fig.  4  The relationships among sinking rates of live diatom, heat-kill cells and diatom shell

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2.4   沉降速率与细胞粒径关系

硅藻活细胞、热致死细胞和硅壳的沉降速率均与细胞的粒径存在极显著的正相关关系（p<0.05），其中粒径的变化可以分别解释75.50%、86.75%和72.34%的硅藻活细胞、热致死细胞和硅壳沉降速率的变化（图5）。同时，粒径对沉降速率的影响还与粒径范围有关，不同粒径范围的沉降速率规律不同（图2）。ESD<25 μm的硅藻活细胞、热致死细胞和硅壳的沉降速率间无显著差异（p>0.05）。而ESD>300 μm的硅藻（哈德掌状藻）的活细胞和热致死细胞的沉降速率虽然差异也不显著（p>0.05），但其硅壳的沉降速率却显著小于活细胞和热致死细胞（p<0.05，图2）。

图  5  细胞直径（ESD）与沉降速率的关系（a, 活细胞；b, 热致死细胞；c, 硅壳）

Fig.  5  Relationships between cell size (equivalent spherical diameter, ESD) and sinking rates (a, live diatom; b, heat-kill cells and c, diatom shell)

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2.5   讨论

实验所用17种硅藻的直径（ESD）为11.49～427.21 µm，体积为99.30～5.10$ \times $10⁶ µm³（表1），海洋中大部分硅藻的粒径均在此范围内。如果将硅藻视为一个标准球形颗粒，那么根据Stokes’公式^[22]，硅藻的沉降速率为：

式中： g为重力加速度；r为等效球形的细胞半径；ρʹ为硅藻的密度；ρ为海水密度；η为海水黏度；ϕ为形状阻力。在相同条件下，硅藻的沉降速率与半径的平方成正比。本研究结果表明，无论是硅藻活细胞、硅壳还是热致死细胞，其沉降速率皆与粒径存在极显著的线性正相关关系，粒径大小可以解释超过72%的硅藻活细胞、硅壳和热致死细胞沉降速率的变化（p<0.01，图5）。因此，粒径作为决定沉降速率大小的关键物理特性，对硅藻活细胞、硅壳和热致死细胞的沉降速率均具有重要影响。

除粒径外，密度也是决定硅藻沉降速率的关键因素^[23]。硅藻细胞的密度由硅壳和细胞内含物的密度共同决定，硅壳和细胞内含物组成在硅藻沉降中发挥重要作用。理论上，硅藻可以通过与外界环境进行物质交换来改变细胞内含物的密度，对沉降速率进行调节，从而影响沉降速率^[24]，但过去的研究认为，由于硅的密度远大于海水，硅壳发挥了决定性的作用^[25]。本研究中，ESD<25 µm硅藻的硅壳、热致死细胞和活细胞之间的沉降速率间无显著差异（p>0.05，图2），沉降速率主要由硅含量（硅壳）决定。回归分析表明，硅藻活细胞的沉降速率只与热致死细胞（包含硅壳和完整的细胞内含物）的沉降速率存在显著的相关关系（p<0.05），与硅壳无显著相关关系（p>0.05，图4），所以猜测细胞内含物对硅藻沉降速率也有重要影响，随着硅藻粒径增大，该影响愈加显著。本研究中绝大部分ESD>25 µm的硅藻活细胞或热致死细胞与硅壳的沉降速率之间存在显著性差异（p<0.05，图2），因此较大粒径的硅藻细胞的沉降速率不仅由硅壳决定，还受到细胞内含物的影响。小粒径（<25 µm）的硅藻内部空间狭小，可以容纳的细胞内含物少，因此细胞内含物对整个硅藻细胞的密度的贡献小，沉降速率主要由硅含量（硅壳）决定，而像哈德掌状藻[直径（427.21 ± 26.58）µm]这样体积“巨大”的硅藻，硅壳内部空间大，细胞内含物对密度的贡献大，从而对硅藻的沉降速率有重要影响（图2）。

对应硅壳和细胞内含物对硅藻沉降速率的影响，硅藻沉降速率调节的方式有两种。第一种方式是通过细胞表面向外伸展的各种突出物如突起、刺、毛、胶质线等与其他细胞相互连接，增加硅藻的浮力^[26]。第二种方式是通过物质交换、改变细胞内含物的密度，从而改变其沉降速率。细胞内含物对硅藻的沉降速率进行调行的研究具有重要的生态学意义，一方面沉降速率受细胞内含物主导的硅藻，可以通过能量代谢，主动、灵活地对自身沉降速率进行调节，及时地对外界环境变化做出响应^[13,27]；另一方面，为储备能量和维持一定体积的细胞内含物，这类硅藻通常体积“巨大”，“巨大”的体积对于硅藻是一把“双刃剑”，虽然可以抵御部分小型捕食者的摄食，但也使其在与其他小型硅藻的营养盐竞争中处于劣势^[28]。

本研究中，ESD<25 µm的硅藻大部分可以通过第一种方式进行沉降速率的调节，比如，旋链角毛藻和牟氏角毛藻、中肋骨条藻、冰河拟星杆藻、盘形菱形藻可分别通过角毛、支持突、细胞间的胶质分泌物、胶质线，将两个或多个细胞连接在一起，增加浮力，调节沉降速率。但实验中ESD<25 µm的硅藻活细胞、硅壳以及热致死细胞的沉降速率间无显著差异（p>0.05，图2），除了上文提及的细胞内部空间狭小、细胞内含物调节能力有限外，可能还与本研究主要以单细胞形态而不是多细胞群体进行实验、硅壳结构的调节作用无法体现有关。然而，ESD<25 µm硅藻中的盘形菱形藻的硅壳沉降速率却具有最大的变异系数，且其硅壳沉降速率的变异系数大于活细胞和热致死细胞（图3），显微镜观察发现该藻并无细胞相互连接现象，因此猜测其变异系数应该是由测量误差引起的，而不是通过细胞连接增加浮力所致。

除短角弯角藻外，直径为25～65 µm的硅藻活细胞沉降速率和热致死细胞沉降速率存在显著差异（p<0.05，图3）。这些种类在野外均能通过硅壳突出物与其他细胞连接，形成群体；但在本研究的人工培养条件下，这些种类的细胞大多数互相独立，其活细胞沉降速率和热致死细胞沉降速率之间的差异是由细胞代谢改变内含物密度造成的。因此，野外条件下这类硅藻应兼具形态调节和细胞代谢调节能力。

本研究中ESD>65 µm 的硅藻均无法通过硅壳表面突出物进行细胞连接，这类细胞的沉降速率调节可能仅依靠物质交换、改变细胞内含物密度的方式进行。据报道，圆筛藻属的硅藻以及哈德掌状藻均具有通过细胞代谢改变内含物密度，快速调节沉降速率的能力，但这种调节受光照和营养盐浓度的影响 ^[27]。本实验中星脐圆筛藻和哈德掌状藻的活细胞和热致死细胞间的沉降速率无显著差异（p>0.05，图3）。这可能是因为沉降速率测定时候的光照和营养盐浓度与培养时无明显差异，不足以引起活细胞对沉降速率进行调节，也可能是因为沉降速率测量的时间相对较短，沉降速率调节的范围较小，从而没有在结果中体现。

由于内含物的密度调节与细胞代谢有关，只能在活细胞中进行。本实验发现，虽然硅藻活细胞的沉降速率与热致死细胞沉降速率存在显著的相关关系（p<0.05），但热致死细胞（包含硅壳和细胞内含物）只能解释36.25%的硅藻活细胞沉降速率的变化（图4 a），大部分ESD>25 µm的硅藻活细胞和热致死细胞的沉降速率存在显著的差异（图2），因此推测细胞的活性也对硅藻的沉降速率具有重要影响，即活细胞可以通过生理活动对其自身的沉降速率进行调节。实验发现变异系数大于0.4的种类中，除盘形菱形藻外，活细胞沉降速率的变异系数均大于硅壳和热致死细胞沉降速率的变异系数（图3），这可能也与活细胞的沉降速率调节有关。

此外，本实验所用的17种硅藻，几何形状各异，硅藻的几何形状也可能对其沉降速率产生影响 ^[26,29]。在相同体积下，简单几何体形状的细胞沉降速率低于复杂几何体形状（由两个以上简单几何体形状叠加）的细胞沉降速率；但对于几何形状和体积均存在差异的硅藻而言，其沉降速率的变化主要受体积影响 ^[29]。本研究除掌状冠盖藻外，其他硅藻均属于简单几何形状，而且17种硅藻的体积也存在明显的差异（表1）。因此推测，不同种类硅藻沉降速率的差异主要是由于体积的不同，引起硅壳和内含物的变化而造成，而不是由细胞几何形状之间的差异造成。

3   结 论

（1）粒径是决定硅藻沉降速率的关键物理因子，不同粒径范围的硅藻，硅壳和细胞内含物对其沉降速率的影响不同，相应的其沉降速率的调节方式也不一样。硅藻的粒径越大，内含物对硅藻沉降速率的影响也越大，沉降速率受细胞内含物主导的硅藻其细胞通常是独立的，且体积较大，这类硅藻沉降速率调节更灵活，对外界环境变化的响应也更及时。硅藻粒径越小，硅壳对其沉降速率的影响越大，这类硅藻通常通过形成群体的方式对沉降速率进行调节。

（2）本研究的17种硅藻中，直径<25 µm的硅藻沉降速率主要受硅含量（硅壳）的影响；直径为25～65 µm的硅藻，其沉降速率受硅含量和细胞内含物密度的共同影响；直径>65 µm的大型硅藻受粒径影响较为明显，粒径越大，细胞内含物在沉降速率中的作用越关键。