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海洋沉积物中一株铁还原细菌ZQ21异化还原Fe(Ⅲ)性质分析

刘洪艳 覃海华 王珊

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海洋沉积物中一株铁还原细菌ZQ21异化还原Fe(Ⅲ)性质分析

    作者简介: 刘洪艳(1977-), 女, 吉林通化人, 副教授, 博士, 主要研究方向为海洋环境微生物, E-mail:hongyanliu1214@163.com;
  • 基金项目: 国家自然科学基金项目 41606157
    天津市自然科学基金项目 16JCYBJC20900

  • 中图分类号: Q949.28

Characteristics of microbial Fe(Ⅲ) reduction by Fe(Ⅲ)-reducing strain ZQ21 from marine sediment

  • CLC number: Q949.28

  • 摘要: 取渤海沉积物进行厌氧培养,富集异化铁还原细菌。采用三层平板法筛选出一株高效异化铁还原细菌ZQ21。经鉴定,该菌株为Enterococcus sp.ZQ21(GenBank号MF192756)。设置不同电子供体、电子受体和电子传递体浓度,分析菌株ZQ21异化还原Fe(Ⅲ)性质。结果表明,在乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸钠、葡萄糖、丙酮酸钠、乙酸钠和甲酸钠为电子供体时,菌株ZQ21利用丙酮酸钠还原Fe(Ⅲ)效率最高,累积Fe(Ⅱ)浓度达到113.14 ±3.46 mg/L。菌株ZQ21以柠檬酸铁和氢氧化铁为电子受体时,累积Fe(Ⅱ)浓度分别为91.75 ±1.45 mg/L和58.39 ±4.34 mg/L,Fe(Ⅲ)还原效率存在显著差异。在电子受体为氢氧化铁时,添加不同浓度电子传递体蒽醌-2-磺酸钠(AQS),旨在提高菌株ZQ21的Fe(Ⅲ)还原效率。当AQS浓度为1.50 mmol/L时,菌株ZQ21还原Fe(Ⅲ)效率最高,累积Fe(Ⅱ)浓度达到80.28 ±3.95 mg/L,比对照组提高27%。铁还原细菌ZQ21能够有效利用可溶性以及不溶性电子受体进行异化铁还原,可进一步应用于海洋污染环境中微生物介导的异化Fe(Ⅲ)还原过程。
  • 图 1  电子显微镜下菌株ZQ 21的细胞形态

    Figure 1.  Cell morphology of the strain ZQ21 under the electronic microscope

    图 2  菌株ZQ21系统进化树

    Figure 2.  Phylogenetic tree by strains ZQ21

    图 3  电子供体对菌株ZQ21细胞生长的影响

    Figure 3.  Effect of electron donor on cell growth by strains ZQ21

    图 4  电子受体对菌株ZQ21细胞生长和Fe(Ⅲ)还原性质影响(图a:柠檬酸铁,图b:氢氧化铁)

    Figure 4.  Effect of electron acceptor on cell growth and Fe(Ⅲ) reduction by trains ZQ21 (a :ferric citrate, b:iron hydroxide)

    图 5  电子传递体(AQS)对菌株ZQ21细胞生长及Fe(Ⅲ)还原性质影响

    Figure 5.  Effects of electron shuttle (AQS) on cell growth and Fe(Ⅲ) reduction by strain ZQ21

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出版历程
  • 收稿日期:  2017-11-22
  • 录用日期:  2018-01-31
  • 刊出日期:  2019-08-20

海洋沉积物中一株铁还原细菌ZQ21异化还原Fe(Ⅲ)性质分析

    作者简介:刘洪艳(1977-), 女, 吉林通化人, 副教授, 博士, 主要研究方向为海洋环境微生物, E-mail:hongyanliu1214@163.com
  • 天津科技大学 海洋与环境学院, 天津 300457
基金项目:  国家自然科学基金项目 41606157天津市自然科学基金项目 16JCYBJC20900

摘要: 取渤海沉积物进行厌氧培养,富集异化铁还原细菌。采用三层平板法筛选出一株高效异化铁还原细菌ZQ21。经鉴定,该菌株为Enterococcus sp.ZQ21(GenBank号MF192756)。设置不同电子供体、电子受体和电子传递体浓度,分析菌株ZQ21异化还原Fe(Ⅲ)性质。结果表明,在乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸钠、葡萄糖、丙酮酸钠、乙酸钠和甲酸钠为电子供体时,菌株ZQ21利用丙酮酸钠还原Fe(Ⅲ)效率最高,累积Fe(Ⅱ)浓度达到113.14 ±3.46 mg/L。菌株ZQ21以柠檬酸铁和氢氧化铁为电子受体时,累积Fe(Ⅱ)浓度分别为91.75 ±1.45 mg/L和58.39 ±4.34 mg/L,Fe(Ⅲ)还原效率存在显著差异。在电子受体为氢氧化铁时,添加不同浓度电子传递体蒽醌-2-磺酸钠(AQS),旨在提高菌株ZQ21的Fe(Ⅲ)还原效率。当AQS浓度为1.50 mmol/L时,菌株ZQ21还原Fe(Ⅲ)效率最高,累积Fe(Ⅱ)浓度达到80.28 ±3.95 mg/L,比对照组提高27%。铁还原细菌ZQ21能够有效利用可溶性以及不溶性电子受体进行异化铁还原,可进一步应用于海洋污染环境中微生物介导的异化Fe(Ⅲ)还原过程。

English Abstract

  • 异化铁还原菌是指以有机物为电子供体,Fe(Ⅲ)为唯一电子受体,将Fe(Ⅲ)还原成Fe(Ⅱ)的一类微生物总称[1-2]。目前认为异化铁还原菌介导的Fe(Ⅲ)还原是自然界中Fe(Ⅲ)还原的主要途径[3-4]。自Lovley等[5]首次从沉积物中分离到异化铁还原菌Geobacter metallireducens GS-15以来,研究人员陆续从萨凡纳河底沉积物[6]、海洋沉积物[7]和活性污泥[8]等各种厌氧环境中,分离出多株异化铁还原细菌。继续广泛筛选异化铁还原效率高的菌株,对拓宽异化铁还原菌的种质资源、提高Fe(Ⅲ)还原效率都具有重要意义。

    微生物介导的异化Fe(Ⅲ)还原是一种氧化还原反应,涉及多种元素的价态变化过程,可驱动重金属解毒与固定。利用微生物异化铁还原去除重金属污染物,是环境污染修复领域的一个新兴研究方向,在环境污染生物修复研究中发挥着重要作用[9]。Watts等[10]发现异化铁还原细菌Geobacter sulfurreducens能够将有毒Cr(Ⅳ)还原生成无毒Cr(Ⅲ),达到对重金属Cr(Ⅳ)的去除作用。Iwahori等[11]利用异化铁还原微生物,制备生物纳米磁铁矿,与普通磁铁矿相比,生物纳米磁铁矿颗粒粒径小(10~50 nm),比表面积大,能够加速对重金属Zn2+, Ni2+, Co2+, 以及Mn2+的去除效率。可见,微生物介导铁还原过程可以有效降低金属污染,在生态环境及生物修复中具有重要的作用。此外,一些铁还原菌能将有机物的厌氧发酵过程与异化Fe(Ⅲ)还原过程相耦联[12-13],分解剧毒有机物,产生新型能源,达到环境污染治理与新型能源开发的双重目的。

    微生物异化Fe(Ⅲ)还原过程易受环境因子影响,如电子供体和电子受体[14-16]。因此,本实验采用渤海沉积物为材料,筛选异化铁还原菌。分析不同培养条件对Fe(Ⅲ)还原效率影响。拓宽应用于海洋环境污染治理的异化铁还原微生物种质资源。

    • 将取自渤海塘沽海域底泥富集培养,富集培养基成分(g/L)如下:葡萄糖20.00,酵母汁1.00,胰蛋白胨4.00,NaCl 4.00,MgCl2 0.10,L-半胱氨酸0.50,K2HPO4 1.50,pH 7.00±0.50。电子受体选择柠檬酸铁(20.00 mmol/L)。取3.00 g海底污泥到50 mL血清瓶(含30 mL培养基),充氮气5 min,保证厌氧条件下富集异化铁还原菌群。温度30℃,转速为100 r/min,摇床培养144 h。富集菌液按1%接种到相同培养基中。测定培养液中Fe(Ⅱ)浓度,分析富集菌群Fe(Ⅲ)还原能力。重复上述步骤3次。目的在于富集异化铁还原混合菌群。

    • 异化铁还原细菌分离培养基成分同富集培养基,琼脂20.00 g/L,pH 7.00±0.05。采用三层平板法分离厌氧异化铁还原细菌,具体步骤:培养皿中倒入第一层固体分离培养基,待完全凝固,划线接种富集菌群;倒入第二层固体培养基;待凝固,倒入第三层无菌石蜡,保证异化铁还原细菌的厌氧环境。30℃倒置培养48 h。分别挑取边缘清晰的单菌落于液体分离培养基中,30℃培养24 h,测定每管培养液中Fe(Ⅱ)浓度。挑取Fe(Ⅲ)还原效率高的菌株,再次划线平板培养。重复上述步骤3~6次,直至获得具有高效Fe(Ⅲ)还原性质的纯菌株。

      利用普通光学显微镜和扫描电镜(日本日立公司),从形态学水平鉴定纯菌株。采用16S rRNA基因序列测定,从分子生物学水平鉴定菌株。具体步骤如下:DNA提取;16S rRNA的PCR扩增;序列测定:扩增引物采用细菌通用引物,27F:5′-AGAGTTTGATCCATGGCTCAG-3′和1541R:5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′。扩增产物由北京奥科生物工程技术服务有限公司进行测序。在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中进行核酸序列的比对,并在MEGA6.0软件中用Neighbour-Joining建立系统进化树,Bootstrap选择1000次。

    • 分析电子供体、电子受体和电子传递体对菌株ZQ21细胞生长和Fe(Ⅲ)还原性质的影响。电子供体分别设置为乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、柠檬酸钠、葡萄糖、丙酮酸钠、乙酸钠和甲酸钠,含碳浓度固定为60.00 mmol/L。电子受体分别设置为人工配制的氢氧化铁和柠檬酸铁,浓度均为20.00 mmol/L。间隔时间取样,测定菌体生长量A600和Fe(Ⅱ)浓度,测定菌株细胞生长和Fe(Ⅲ)还原性质随时间的变化规律。电子传递体蒽醌-2-磺酸钠(AQS)浓度设置为0.00、0.25、0.50、1.00、1.50和2.00 mmol/L。菌液按1%接种于20 mL厌氧螺口管内,30℃恒温培养。培养结束后,测定菌体细胞生长量A600,培养液累积生成Fe(Ⅱ)浓度。分析培养条件对菌株生长和Fe(Ⅲ)还原性质影响。每组实验重复3次。

    • 细胞生长量A600通过培养液在600 nm处吸光值表示。pH采用雷磁PHS-3C型pH计测量(上海仪电科学仪器股份有限公司)。培养液中Fe(Ⅱ)浓度采用邻菲罗啉比色法测定[17]:取1 mL培养液,置于4 mL盐酸(0.5 mol/L)溶液中,在30℃下静置浸提24 h, 离心,3 000 g,5 min。取上清液500 μL,1 mL邻菲罗啉(0.1%)和1 mL乙酸乙酸钠(pH=4.6)于比色管中,蒸馏水定容至10 mL,摇匀、静置10 min,于510 nm处测定吸光值。

    • 厌氧培养条件下,分离纯化一株异化铁还原细菌ZQ21。在光学显微镜下菌株形态一致,是革兰氏阳性细菌。扫描电子显微镜观察菌株ZQ21,细胞形状为圆球型,菌体大小0.25~0.80 μm,以二分裂法进行无性繁殖。

      图  1  电子显微镜下菌株ZQ 21的细胞形态

      Figure 1.  Cell morphology of the strain ZQ21 under the electronic microscope

      菌株ZQ21的16S rRNA序列进行PCR扩增,测序获得序列大小为1441 bp,GenBank为MF192756。采用BLAST和ClustalW程序与GenBank数据库中的16S rRNA序列进行比对分析,并构建系统发育树(图 2)。结果显示,菌株ZQ21与Enterococcus sp.N4(HQ600998.1)处于同一分支上,亲缘关系最近。因此,菌株ZQ21命名Enterococcus sp.ZQ21。

      图  2  菌株ZQ21系统进化树

      Figure 2.  Phylogenetic tree by strains ZQ21

    • 电子供体,如乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、柠檬酸钠、葡萄糖、丙酮酸钠、乙酸钠和甲酸钠,含碳浓度为60.00 mmol/L。菌株ZQ21在不同电子供体下的细胞生长,见图 3。当柠檬酸铁为电子受体时,菌株ZQ21有效利用葡萄糖和丙酮酸钠为电子供体进行细胞生长。当氢氧化铁为电子受体时,菌株ZQ21有效利用葡萄糖、丙酮酸钠和柠檬酸钠为电子供体进行细胞生长。当电子供体设置为EDTA-2Na、甲酸钠和乙酸钠时,无论是柠檬酸铁还是氢氧化铁作为电子受体,菌株ZQ21都无法生长。

      图  3  电子供体对菌株ZQ21细胞生长的影响

      Figure 3.  Effect of electron donor on cell growth by strains ZQ21

      不同电子供体对菌株ZQ21的Fe(Ⅲ)还原效率影响具有显著差异。当柠檬酸铁为电子受体时,菌株ZQ21利用葡萄糖和丙酮酸钠为电子供体异化还原Fe(Ⅲ)效率较高,培养液中积累Fe(Ⅱ)浓度分别是93.45±2.57 mg/L和113.14±3.46 mg/L。葡萄糖是一种单糖,能够快速被细胞吸收而经糖酵解途径分解[18],丙酮酸是糖酵解的中间代谢产物。因此,葡萄糖和丙酮酸钠作为电子供体能够较高效率地促进Fe(Ⅲ)还原过程。当氢氧化铁为电子受体时,菌株ZQ21同样能够利用葡萄糖和丙酮酸钠作为电子供体,进行异化Fe(Ⅲ)还原,培养液累积Fe(Ⅱ)浓度分别为91.38±2.41 mg/L和82.78±4.35 mg/L。实验结果与He等[19]研究结果相一致,氢氧化铁为电子受体时,铁还原细菌能够有效利用葡萄糖和丙酮酸钠作为电子供体进行异化Fe(Ⅲ)还原。柠檬酸铁和氢氧化铁作为电子受体时,菌株ZQ21都不能有效利用乙酸钠作为电子供体,进行异化Fe(Ⅲ)还原。这与关舒元等[20]研究结果相似,菌株P4不能有效利用乙酸钠为电子供体进行异化Fe(Ⅲ)还原。

    • 电子受体,如柠檬酸铁和氢氧化铁,对菌株ZQ21细胞生长和Fe(Ⅲ)还原性质影响(见图 4)。柠檬酸铁为电子受体时,菌株ZQ21在10 h时进入细胞对数生长期并开始累积Fe(Ⅱ)。在连续培养25 h时,细胞生长量A600达到1.10±0.13,累积Fe(Ⅱ)浓度为90.84±1.95 mg/L。当继续培养到30 h时,培养体系累积Fe(Ⅱ)浓度几乎没有变化,达到一个相对稳定水平。表明菌株ZQ21在以柠檬酸铁为电子受体时,体系累积Fe(Ⅱ)主要发生在细胞对数生长期。菌株ZQ21细胞生长和Fe(Ⅲ)还原能力成显著的正相关,这与Zhou Z M等[21]研究结果相一致,在可溶性铁为电子受体时,铁还原菌Klebsiella sp.FD-3的Fe(Ⅲ)还原效率与细胞生长呈显著的正相关。

      图  4  电子受体对菌株ZQ21细胞生长和Fe(Ⅲ)还原性质影响(图a:柠檬酸铁,图b:氢氧化铁)

      Figure 4.  Effect of electron acceptor on cell growth and Fe(Ⅲ) reduction by trains ZQ21 (a :ferric citrate, b:iron hydroxide)

      氢氧化铁为电子受体时,菌株ZQ21在10 h时进入细胞对数生长期。在30 h时,细胞生长量A600达到0.573±0.02。菌株ZQ21在细胞对数生长后期和稳定期才开始累积Fe(Ⅱ)。在连续培养30 h时,体系累积Fe(Ⅱ)浓度为58.39±1.34 mg/L。当培养到90 h时,体系累积Fe(Ⅱ)浓度达到最大,为104.48±0.90 mg/L。表明在以氢氧化铁为电子受体时,菌株ZQ21的Fe(Ⅲ)还原过程主要发生在细胞对数生长后期和稳定期。研究结果进一步证实异化铁还原微生物最容易利用可溶性Fe(Ⅲ)和络合态Fe(Ⅲ),其次是弱晶体Fe(Ⅲ)氧化物,最难利用的是Fe(Ⅲ)氧化物晶体[22]

    • 铁在自然界中大多以不溶性的形式存在,如磁铁矿、褐铁矿、赤铁矿和黄铁矿等。为提高菌株ZQ21利用不可溶性电子受体的Fe(Ⅲ)还原效率,添加不同浓度电子传递体蒽醌-2-磺酸钠(AQS),分析AQS对菌株ZQ21细胞生长和Fe(Ⅲ)还原效率的影响,结果见图 5

      图  5  电子传递体(AQS)对菌株ZQ21细胞生长及Fe(Ⅲ)还原性质影响

      Figure 5.  Effects of electron shuttle (AQS) on cell growth and Fe(Ⅲ) reduction by strain ZQ21

      在设定AQS浓度范围内(0.00~2.00 mmol/L),实验组细胞生长量相比对照组(未添加AQS)均有所提高,这表明AQS对细胞生长具有促进作用。当AQS浓度为0.25 mmol/L时,菌株细胞生长量最高(A600为0.70±0.03),较对照组提高36%。研究结果表明,低浓度AQS(0.25 mmol/L)对菌株ZQ21细胞生长影响最为显著。随着电子传递体的浓度增加,出现了先下降后上升的现象。AQS浓度达到1.00 mmol/L时,实验组中菌株细胞生长量最低(A600为0.58±0.02),这可能是电子传递体AQS浓度的变化影响了异化铁还原菌的生长[16]

      在设定AQS浓度范围内,实验组累积Fe(Ⅱ)浓度均比对照组高。AQS浓度在0.00~1.50 mmol/L范围内,菌株ZQ21的Fe(Ⅲ)还原能力随AQS浓度增加而增高。当AQS为1.50 mmol/L时,菌株ZQ21的Fe(Ⅲ)还原效率最高,累积Fe(Ⅱ)浓度达到80.28±3.95 mg/L,比对照组提高27%。这与Lovley等[23]研究结果一致,电子传递体可促进Fe(Ⅲ)与Pyrobaculum islandicum之间的电子传递,加速Fe(Ⅲ)还原。

    • 异化铁还原细菌Enterococcus sp.ZQ21分离自海洋沉积物。以柠檬酸铁和氢氧化铁为电子受体时,菌株ZQ21具有明显Fe(Ⅲ)还原性质。菌株能够有效利用丙酮酸钠为电子供体,进行Fe(Ⅲ)还原,累积Fe(Ⅱ)浓度达到113.14±3.46 mg/L。电子传递体蒽醌-2-磺酸钠(AQS)浓度1.50 mmol/L时,菌株ZQ21的Fe(Ⅲ)还原效率显著增加,累积Fe(Ⅱ)浓度比对照组提高27%。菌株ZQ21能够利用Fe(Ⅲ)作为电子受体,特别是不溶性氢氧化铁作为电子受体进行异化铁还原。这表明该菌株可进一步应用于环境污染的治理。

参考文献 (23)

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