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一种用于浮游植物检测能力评估的比测方法

杨振雄 董燕红 娄全胜 肖瑜璋 姜广甲

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一种用于浮游植物检测能力评估的比测方法

    作者简介: 杨振雄(1986-), 男, 广东韶关人, 工程师, 硕士, 主要从事海洋生态监测工作, E-mail:snrdfdcw@163.com, 250164494@qq.com;
  • 基金项目: 国家自然科学基金项目(41501411);我国近岸重要生物毒素检测技术产品化及业务化应用示范(201305010)
  • 中图分类号: X830.2;X835;X834

A case study on phytoplankton identifying proficiency test

  • 摘要: 针对日益增加的海洋生态监测质量管理需求与当前海洋生物监测数据考核方法不足的现状,研究了一种新型的浮游植物比测方法,并用于2016年全国浮游植物样品比测活动,该活动是国家海洋局组织的,旨在对全国计划单列市及以上的海洋环境监测机构的浮游植物鉴定能力进行评估。结果表明,该方法制片效果良好,符合有关规范要求,评估结果具有科学性、合理性,可适用于海洋生态监测质控管理。采用该方法总体上客观检验了当前各海洋监测机构海洋浮游植物检测的技术能力和水平,对各单位业务能力的提升有积极推动作用。
  • 图 1  标准比测样片制备流程

    Figure 1.  The process of standard sample preparaion

    图 2  新型浮游植物比测样片制备方法

    Figure 2.  A new type of phytoplanton sample preparative technique

    图 3  现场比测流程

    Figure 3.  The process of comparing measurement

    图 4  比测全过程质量控制

    Figure 4.  Total process quality control

    图 5  浮游植物比测样片效果

    Figure 5.  The design sketch of phytoplanton sample

    表 1  结果评判依据

    Table 1.  The judgment basis

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出版历程
  • 收稿日期:  2018-03-08
  • 录用日期:  2018-07-10
  • 刊出日期:  2019-10-20

一种用于浮游植物检测能力评估的比测方法

    作者简介:杨振雄(1986-), 男, 广东韶关人, 工程师, 硕士, 主要从事海洋生态监测工作, E-mail:snrdfdcw@163.com, 250164494@qq.com
  • 国家海洋局南海环境监测中心, 广东 广州 510300
基金项目: 国家自然科学基金项目(41501411);我国近岸重要生物毒素检测技术产品化及业务化应用示范(201305010)

摘要: 针对日益增加的海洋生态监测质量管理需求与当前海洋生物监测数据考核方法不足的现状,研究了一种新型的浮游植物比测方法,并用于2016年全国浮游植物样品比测活动,该活动是国家海洋局组织的,旨在对全国计划单列市及以上的海洋环境监测机构的浮游植物鉴定能力进行评估。结果表明,该方法制片效果良好,符合有关规范要求,评估结果具有科学性、合理性,可适用于海洋生态监测质控管理。采用该方法总体上客观检验了当前各海洋监测机构海洋浮游植物检测的技术能力和水平,对各单位业务能力的提升有积极推动作用。

English Abstract

  • 近年来,随着海洋环境监测业务工作的广泛开展,国家对海洋环境监测质量管理越来越重视。目前,有关海洋水质和沉积物的质量控制技术已经成熟运用开展,如水质监测质控措施就有平行样分析、加标样、标准样、空白样分析等方法[1-2],但有关海洋生态监测质控措施较少,主要集中在实验室内部质量控制中对微生物和叶绿素a的质控[2-4],其方式与水质相似,采用平行双样分析为主,其他如浮游植物、浮游动物等仍以人力鉴定分类为基础的项目却未有成熟或可全面推广的标准化检测评估手段。

    当前,传统的形态学鉴定分类法广泛运用于我国业务化海洋生态监测中[3-4],该方法是以人为主的数据产出,要求技术人员具有较强的业务能力和鉴定技术水平,对海洋生态监测数据的评价很大程度上就是对技术人员检测能力的评价。以国家海洋局赤潮外送样考核为例,这就是一项对技术人员鉴定能力考核的工作,可在一定程度上较好评价各机构检测赤潮生物的数据质量。但该工作也存在较显著的不足:一方面是考核范围较窄,主要集中在赤潮生物种类;另一方面是考核样一般为一定体积的浓缩液,要求被考核人员自行配制分析样片,而自行取样制片过程中将出现无法避免的误差,且随着取样次数的增加样品将会出现损耗,可能导致实际分析的样片浓度不稳定,与标准结果存在较大误差。因此,基于对传统鉴定分类数据质量评价的需求,仍需探求一种具有代表性且误差较小的定量考核方式。此外,传统浮游植物标本制片法常使用去除色素体等有机质的永久玻片制备方法。尽管该方法可以长期保存海洋浮游植物标本,但由于将海洋浮游植物色素体等关键鉴定分类信息去除,在海洋植物监测业务上并不适用,亦不能满足制备标准样片用于海洋浮游植物检测能力评估的要求。

    因此,本研究基于国家海洋局《全国海洋生态环境监测质量管理三年行动计划》(2015-2017)的业务要求,积极创新并探讨了一种可用于浮游植物比测的标准方法,以期用于检验各海洋监测机构的浮游植物鉴定和计数水平,有助于提升其业务能力,提高海洋生态监测数据质量。

    • 为确保制备的标准样片符合海洋生态监测人员现实业务工作中常见的监测样本,本研究采用了综合标准样品比测法。该方法首先要求制备这样一类浮游植物标准样片:样品是经由现场采集及混入培养纯藻种,经固定可保留色素体等关键分类信息,并在一定时期内可有效保存,其结果为综合权威专家鉴定统计后形成的。采用现场集中比测方式通过对该标准样片进行种类鉴定、数量计算等定性、定量分析,可科学、有效评估各监测机构对浮游植物的基本检测能力。有关综合标准样片制备原则如下:

      (1) 样品种类数适宜,控制在30种左右;

      (2) 样品个体数量适宜(100个/片~300个/片),种间个体数量差异适宜;

      (3) 样品主要种类为国内常见海区优势种,以广温广布种为主;

      (4) 主要种类在形态学鉴定上不存在较大争议;

      (5) 样片观察效果好,样品质量应达到常规业务监测要求;

      (6) 样本保存效果好,可较长时间(可保存至少3个月)保留大部分藻类信息。

      此外,由于本研究结果用于各个实验室间的浮游植物检测能力比对,涉及全国不同类型的单位,为提高评价工作效率,在保证结果评价具有科学性、合理性和有效性的前提下,需尽量简化评价流程,避免评价方法复杂化。因此,结果评价上采用了简易的赋值评分法。

    • 本研究结合2016年全国海洋生态环境监测质量保证工作方案要求,以2016年全国海洋浮游植物比测活动为例,制定了如下浮游植物比测流程。

      (1) 综合标准样片制备(详见图 1)

      图  1  标准比测样片制备流程

      Figure 1.  The process of standard sample preparaion

      采集并选取具有代表性的近岸海域浮游植物样品,并补充单株活体藻种,制作成半永久样片,委托国内权威海洋浮游植物专家进行鉴定,并根据专家分析结果挑选综合比测样片,最终形成比测标准答案。最后根据参与比测机构数量,配置综合比测样片,完成比测样品的编号、封存。需要说明的是,从藻种库挑选的培养种类,主要为常见赤潮种,并选取形态学结果特征与自然生活状态保持一致的种类,避免室内培养条件下部分藻种形态发生变化的干扰。

      此外,参考已有研究报道的标本玻片制备技术[5-10],经过多次试验,本研究创新了一种适用于本次比测活动的浮游植物标本的制备方法,该方法已申报了国家发明专利。该方法首先创新了一种浮游植物标本包埋剂,由此方法制得的浮游植物标本最大程度保留了海洋浮游植物细胞信息,为准确的形态学鉴定分类提供基础。其主要制备方法如下(详见图 2):

      图  2  新型浮游植物比测样片制备方法

      Figure 2.  A new type of phytoplanton sample preparative technique

      ① 挑选种类和数量适宜的、经过固定的微藻样品;

      ② 使用过滤器去除浮游动物等非微藻类杂质,并最终将样品附在膜上;

      ③ 使用混合固定液清洗膜上的样品;

      ④ 预先计算好加样体积。先加一定体积混合固定液,再依次把各个样品按照体积数添加至固定液上,全部样品添加完成后盖上盖玻片;

      ⑤ 静置,待藻细胞中后固化,加树脂封片;

      ⑥ 半永久封片应在冷藏保存。

      (2) 现场比测流程

      根据比测要求,成立质量监督组。质量监督组负责比测工作的现场监督及评卷工作,并报告现场比测工作情况。各参与比测机构选派两名技术人员于指定时间内完成一个综合比测样片的分析工作,并填报有关记录和答卷。具体流程见图 3

      图  3  现场比测流程

      Figure 3.  The process of comparing measurement

      (3) 结果评定规则

      a) 采用结果赋值评定法;

      b) 结果判定内容包括对样品的种类和数量的判定,以正确率为评判标准,并分级赋值评分。赋值采用百分制,满分为100分。其中,种类结果评定包括浮游植物种类评定,赋值60分;数量结果评定是指对浮游植物细胞总数量的评价,赋值40分。需要说明的是,由于制作的浮游植物标本种类均为常见种,因此,除个别属外(如拟菱形状藻属、角毛藻属、圆筛藻属等),种类鉴定原则上要求鉴定到种,种类赋值以判定出多少种类数的比例赋值。数量结果评定是以细胞总数量误差率评定。具体评定依据见表 1

      表 1  结果评判依据

      Table 1.  The judgment basis

      c) 结果评定标准:

      总分≥80,评定为优秀;

      60≤总分 < 80,评定为良好;

      40≤总分 < 60,评定为合格;

      总分 < 40,评定为不合格。

    • 为确保浮游植物比测全过程质量保证可控,在标准样片制备、标准答案选取和样片数量评分等几个方面进行了质控设计(如图 4所示)。

      图  4  比测全过程质量控制

      Figure 4.  Total process quality control

    • 采集了海洋浮游植物样品,并按照本研究浮游植物标本的制备方法制备标本,经包埋封胶后的浮游植物标片如图 5-①所示,将样片于光学显微镜下观察并拍照,部分样片拍照效果如图 5-②-⑦所示。其中,②为活动盒形藻(Biddulphia mobiliensis)200倍光镜下的效果图;③为具尾鳍藻(Dinophysis caudata)200倍光镜下的效果图;④为旋链角毛藻(Chaetoceros curvisetus)200倍光镜下的效果图;⑤为波状石丝藻(Lithodesmium undulatum)400倍光镜下的效果图;⑥为米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)200倍光镜下的效果图;⑦为拟菱形藻(Pseudo-nitzschia sp.)200倍光镜下的效果图。由图可见,按照本方法制得的海洋浮游植物标本,细胞保持完好,结构特征明显,色素体显著。

      图  5  浮游植物比测样片效果

      Figure 5.  The design sketch of phytoplanton sample

    • 以2016年9月国家海洋局组织的全国海洋浮游植物比测为例,由全国计划单列市及以上的近20家海洋环境监测机构参与。根据参与比测机构数量,配置综合比测样片30片。本次比测结果显示40%的机构种类正确率在70%以上,50%的机构总数量误差率在30%以下,各机构在海洋浮游植物的鉴定能力上可在较大程度上量化区分,评价结果符合正态分布规律,体现了样品选择和评价方法的合理性,比测活动具有科学性。

    • 我国海洋环境监测质量控制工作主要通过自控和他控两种方式开展。自控主要指监测机构内部采用的质量控制方法,其最终体现在检测数据能否达到检测方法所对应的最佳测量不确定度。他控是指监测机构以外的具有相关资质的机构对监测机构进行的质量控制方法,如上级主管部门或参加由中国合格评定国家认可委员会等组织的能力验证及实验室间比对,通过此类方式对实验室资质方面进行相应的考核[11]。而本研究提供的浮游植物标准样片比测方法是一种采样间接手段对各机构浮游植物检测能力进行自控或他控的方法。2016年全国比测活动就是一种用于实验室间比对的他控措施。从对海洋生态监测数据质量控制来看,基于以人为主的鉴定数据产出现状,其质控措施主要集中在对技术人员鉴定能力水平的考核,必然要求减少鉴定过程中客观的取样误差和主观的人为判读误差。以海洋浮游植物比测为例,制作标准化的海洋植物标片就是这样一个评价人为鉴定数据质量水平的实践。

      制作标准化的海洋植物标片的前提还需要一项可满足用于海洋浮游植物比测的制片技术。由于当前海洋浮游生物标本标准化制作的技术较少[5-10],与海洋浮游植物相关的制片技术更少,已公开的方法均主要用于易于固定且细胞内含物可较完整保存的大中型生物标本或者人体组织标本,或者是用于提高显微镜清晰度的方法,均未涉及可较长时间固定保留海洋浮游植物细胞特征的标本制作方法。与现有技术相比,本研究创新性提出了一种浮游植物标本的标准化制备方法,并采用了一种适当的包埋剂,不仅不会破坏浮游植物细胞,还具有较好的光学通透性,可在较完整保留浮游植物细胞信息,为准确的形态学鉴定分类提供基础。此外,该方法采用树脂封片后,隔绝了空气,有效避免了色素体等有机质受微生物分解,使得标本可较长时间保存。通过浮游植物标本制备技术在2016年的浮游植物比测活动中较好地检验了各海洋监测机构海洋浮游植物检测的技术能力和水平。

      尽管本方法在2016年浮游植物比测活动中有较好的运用,但在实践中仍发现一些问题:如样品采样过程中自然采集的浮游植物样品经固定后易形成絮状,导致制片过程中难以分离出纯种,且多数小型甲藻样品经固定后易破碎变形,因此使用自然状态的浮游植物样品进行制片存在较大的问题;再如本研究提出的质控评价方法较为简单,在生物量评价上仅采用了浮游植物细胞总数量评价,没有反映各种类或主要优势种的数量,不能完全体现鉴定结果的准确性。有关问题的产生一方面是为避免评价流程的复杂化,另一方面也是目前未能找到一种更科学的、易操作的和高效的统计评价方法。此外,为避免质控监督工作仅限于对质量管理要素定性评价、缺乏统一的评价标准、综合评价结果缺乏说服力和严谨性等问题[12],仍需构建一项可为完善且有效指导被监督单位的综合评价法。以上问题都是本研究未来需进一步思考和实践的。

      此外,针对当前传统的形态学分类存在诸如表型的延展性和基因的变异性在物种鉴别时可能导致不正确的鉴定、常规形态学鉴定忽视了形态上的隐藏分类单元[13]以及形态学分类方法费时、费力等问题,许多学者探索了藻类自动鉴定的方法和仪器[14],发展了包括基于藻细胞形态的与计算机技术结合的图像法,基于藻类色素组成的吸光光度法、荧光分光光度法和高效液相色谱法,基于藻细胞大小、色素组成、DNA等的流式细胞仪法,基于细胞分子系列的分子探针法[15],还有表观和固有光谱法、卫星技术以及基于荧光光谱法的技术等[16]。其中,基于藻细胞形态的与计算机技术结合的图像法是当前快速鉴定分类的趋势,海洋浮游植物在壳面形态结构方面存在明显的种间差异性,这种差异性可以借助显微镜扫描系统来进行区分。高亚辉等[15]就通过建立了一套浮游植物的特征数据库,并通过显微镜扫描系统和计算机等形成一套浮游植物自动识别鉴定系统。可以预见的是,未来如果发展和推广了这样一套浮游植物自动化鉴定的软件和程序,并逐步建立相应质量控制体系,就能有效减少人的影响,而我们在海洋浮游植物监测的质量管理上也会有量化标准,这也是解决目前海洋生态监测质控困境的一种新出路。

    • 针对日益增加的海洋生态监测质量管理需求与当前海洋生物监测数据考核方法不足的现状,研究了一种新型的浮游植物比测方法,并成功试用于2016年全国浮游植物样品比测活动,采用该方法总体上客观检验了当前各海洋监测机构海洋浮游植物检测的技术能力和水平,对各单位业务能力的提升有积极推动作用。随着生态文明建设的不断深入,国家海洋局提出了海洋督查工作将涵盖海洋生态环境的专项质量督查,对海洋生态监测数据的考核也将纳入了督察工作内容。因此,研究并完善海洋生态监测质量管理评价方法,特别是建立对技术人员鉴定能力的标准化评估方法,切实提升海洋生态监测数据质量,具有迫切的现实意义。

参考文献 (16)

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