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抗萘单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

周勇 韩德明 马煜宁 程金平

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抗萘单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

    作者简介: 周勇(1993-), 男, 福建泉州人, 硕士研究生, 主要研究方向为环境科学与工程, E-mail:SJTUJohn@sjtu.edu.cn;
    通讯作者: 马煜宁, 讲师, E-mail:yuningma@sjtu.edu.cn
  • 基金项目: 科技部海洋重大专项(2016YFC1402403)
  • 中图分类号: X830.2

Development of hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies against naphthalene

  • 摘要: 为了构建针对石油运输泄露导致的海洋环境中萘等多环芳烃污染的免疫学快速检测方法,需获得高效稳定的分泌抗萘单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本文以2-萘丁酸-KLH为免疫抗原免疫BALb/c小鼠,间接竞争ELISA测定小鼠血清效价,用细胞融合筛选技术筛选抗萘单克隆抗体杂交瘤细胞株,捕获ELISA测定小鼠免疫球蛋白亚型。结果显示,实验小鼠免疫血清效价最高能达到1:80000,经过HAT筛选、复检和亚克隆后得到5个能分泌抗萘单克隆抗体的细胞株,细胞株上清液效价最高能达到1:15625,抗萘单克隆抗体免疫球蛋白亚型均为IgG1,Kappa轻链。本方法成功构建的杂交瘤细胞株能稳定高效分泌抗萘单克隆抗体,抗体亚型符合免疫学检测的特性,为萘的ELISA检测方法建立及胶体金免疫层析(GICA)试纸条的研制提供了稳定高效的单克隆抗体源。
  • 图 1  免疫小鼠血清效价横向评价

    Figure 1.  Transverse evaluation of serum titer in immunized mice

    图 2  免疫小鼠血清间接竞争ELISA

    Figure 2.  Indirect competitive ELISA in serum of immunized mice

    图 3  杂交瘤细胞株间接竞争ELISA

    Figure 3.  Indirect competitive ELISA in thehybridoma cells strain

    表 1  人工抗原的偶联比

    Table 1.  The coupling ratio of 2-naphthalenebutanoic acid-KLH

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    表 2  免疫小鼠血清效价测定(P/N)

    Table 2.  Serum titer measurement of the immunized mice (P/N)

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    表 3  细胞株上清效价测定(P/N)

    Table 3.  Cell line supernatant titer (P/N)

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    表 4  单克隆抗体亚型鉴定

    Table 4.  The subtype of McAb

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出版历程
  • 收稿日期:  2017-12-28
  • 录用日期:  2018-02-28
  • 刊出日期:  2019-10-20

抗萘单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

    作者简介:周勇(1993-), 男, 福建泉州人, 硕士研究生, 主要研究方向为环境科学与工程, E-mail:SJTUJohn@sjtu.edu.cn
    通讯作者: 马煜宁, 讲师, E-mail:yuningma@sjtu.edu.cn
  • 上海交通大学 环境科学与工程学院, 上海 200240
基金项目: 科技部海洋重大专项(2016YFC1402403)

摘要: 为了构建针对石油运输泄露导致的海洋环境中萘等多环芳烃污染的免疫学快速检测方法,需获得高效稳定的分泌抗萘单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本文以2-萘丁酸-KLH为免疫抗原免疫BALb/c小鼠,间接竞争ELISA测定小鼠血清效价,用细胞融合筛选技术筛选抗萘单克隆抗体杂交瘤细胞株,捕获ELISA测定小鼠免疫球蛋白亚型。结果显示,实验小鼠免疫血清效价最高能达到1:80000,经过HAT筛选、复检和亚克隆后得到5个能分泌抗萘单克隆抗体的细胞株,细胞株上清液效价最高能达到1:15625,抗萘单克隆抗体免疫球蛋白亚型均为IgG1,Kappa轻链。本方法成功构建的杂交瘤细胞株能稳定高效分泌抗萘单克隆抗体,抗体亚型符合免疫学检测的特性,为萘的ELISA检测方法建立及胶体金免疫层析(GICA)试纸条的研制提供了稳定高效的单克隆抗体源。

English Abstract

  • 萘属于多环芳烃类化合物(PAHs),被美国环境保护署列为优先控制的16种PAHs污染物之一,是生产合成树脂、增塑剂、橡胶防老剂、表面活性剂、合成纤维、染料、涂料等的原材料,广泛使用的萘已经成为一种典型的环境污染物[1]。近年来PAHs在河流和海洋中也均有不同程度检出[2-3]

    16种优先控制PAHs中,2~3环PAHs的急性毒性较强[4],且2~3环PAHs疏水性相对较弱,蒸气压低,能够相对容易通过挥发进入大气中,为了最大程度的避免萘等2~3环PAHs在不同环境介质中的蔓延[5],需要即时对它进行快速检测。

    对环境中萘等PAHs小分子污染物的检测方法报道较多的有质谱法(MS)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱(HPLC)、GC-MS、HPLC-MS、超声萃取和免疫学检测等方法[6-8]。权衡海洋环境现场的复杂性以及仪器的便携性,大型质谱、色谱等设备不适宜在海洋环境现场进行大规模使用,而免疫学检测方法同时具有灵敏度高、特异性强、使用方便、成本低和适用于现场大批量检测等优点而受到越来越广泛的关注[9],酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent assay, 简写ELISA)和胶体金免疫层析技术都是基于免疫学方法建立起来的检测技术,这两种方案均需要制备特特异单克隆抗体,目前关于萘的单克隆抗体制备的研究相对较少,只有孟星宇等利用活化酯法偶联萘与BSA构建人工免疫抗原做过相关研究[10],但并未见有相关实际应用报道。

    在16种优先控制的PAHs中,萘是目前尚无明显证据证明其对人体具备致癌性的物质,在免疫学检测的构建中能一定程度避免药物致癌性对生物体免疫反应的影响。同时,萘作为16种优先控制的PAHs中结构最简单的物质,在免疫学检测方法构建中,结构越简单构建难度越大[11-14],优先对抗萘单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建有利于其余PAHs的免疫学检测方法的建立。

    本研究旨在为海洋环境中的萘进行免疫学快速检测的实际应用提供研究基础,利用自制的完全免疫抗原2-萘丁酸-KLH免疫Balb/c小鼠,以杂交瘤细胞融合筛选技术和间接竞争ELISA实验建立能分泌抗萘单克隆抗体的细胞株,为ELISA检测试剂盒及Gold Immunochromatography Assay(简写GICA)纸条的开发提供抗体源。

    • 2-萘丁酸、萘、钥孔血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)、DMEM培养基、胎牛血清,福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、HAT、HT、PEG-1450(Sigma)、山羊抗小鼠hrp标记的二抗、EDC、PBS、DMSO、5%脱脂奶粉、紫外分光光度计、酶标仪、高速冷冻离心机。

    • 以2-萘丁酸为半抗原偶联物,利用碳二亚胺法偶联制备2-萘丁酸-KLH免疫抗原和2-萘丁酸-OVA包被抗原,将2-萘丁酸用DMSO配置成50 mg/mL溶液,KLH和OVA用偶联缓冲液配置成10 mg/mL溶液,EDC用无菌水配置成10 mg/mL溶液。

      A组取2-萘丁酸2.00 mg(40 μL)加到375 μL pH 7.5的偶联缓冲液中室温下反应2 h并置于4℃冰箱过夜,后加100 μL KLH(10 mg/mL)再加100 μLEDC(10 mg/mL),混合室温旋转反应2 h,加600 μL PBS, 在透析袋中用1000 mL PBS 4℃透析72 h。

      B组取2-萘丁酸1.00 mg(20 μL)加到250 μL pH 7.5的偶联缓冲液中室温下反应2h并置于4℃冰箱过夜,后加100 μL KLH(10 mg/mL)在加400 μLEDC(10 mg/mL),混合室温旋转反应2 h,加400 μL PBS, 在透析袋中用500 mL PBS 4℃透析72 h。2-萘丁酸-OVA用相同的方法合成,用分光光度计法测定人工抗原的偶联比。

    • 免疫小鼠为12只5~8周周龄的雌性BALb/c小鼠,并于首次免疫前采血制备阴性血清对照。

      分别在第1、15、29、36 d,每组取2-萘丁酸-KLH用PBS稀释至0.6 mg/mL,取1000 μL 2-萘丁酸-KLH与1000 μL福氏完全佐剂混合,乳化,每只小鼠注射100 μg免疫抗原。

      第43 d,对小鼠摘除眼球静脉采血,收集血清,-20℃保存备用。

    • 经过包被、封闭、加样、洗涤、加二抗、洗涤、加TMB显色底物、加终止液等操作,最后读数,并进行针对萘和2-萘丁酸的间接竞争ELISA实验计算抑制率[15]

      利用聚乙二醇(PEG)诱导细胞融合法,以PEG1450为媒介将获得的小鼠SP2/0细胞和脾细胞进行融合并做ELISA检测[16]

      利用克隆技术对获得的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆[17],并对细胞培养上清液进行ELISA检测。取阳性亚克隆孔进行建株保存。

    • 利用标准抗亚类血清系统捕获ELISA法确定单克隆抗体的亚型。细胞株上清液效价检测方法同1.2.3所示。

    • 利用分光光度计法对两组免疫抗原2-萘丁酸-KLH的偶联比进行计算,如表 1所示。

      表 1  人工抗原的偶联比

      Table 1.  The coupling ratio of 2-naphthalenebutanoic acid-KLH

      有研究表明偶联比在10~20区间时[18],有利于单克隆抗体制备,A、B两组免疫抗原偶联比均处于这个区间,可用于制备单克隆抗体。

    • 间接竞争ELISA方法测定免疫血清效价,其P/N值如表 2所示,以P/N值≥2.1的阳性标准,可以判断两组小鼠血清效价最高均能达到1: 80000,实验小鼠均获得了良好的免疫效果。

      表 2  免疫小鼠血清效价测定(P/N)

      Table 2.  Serum titer measurement of the immunized mice (P/N)

      对A、B两组免疫小鼠血清效价测定结果进行横向评价如图 1所示,A组小鼠血清效价指标P/N值波动幅度在不同血清稀释度下均明显大于B组小鼠,可初步判断用于B组小鼠注射的2-萘丁酸-KLH免疫抗原免疫效果较稳定。

      图  1  免疫小鼠血清效价横向评价

      Figure 1.  Transverse evaluation of serum titer in immunized mice

      对实验小鼠获得的免疫血清进行针对2-萘丁酸和萘的间接竞争ELISA实验。两组实验小鼠中共7个免疫血清样品对萘有明显抑制效果,抑制效果如图 2所示。

      图  2  免疫小鼠血清间接竞争ELISA

      Figure 2.  Indirect competitive ELISA in serum of immunized mice

      可见A-1、A-3、A-5、B-1、B-3、B-4、B-6,共7只小鼠血清对萘的抑制效果达到45%以上。选取这7只免疫小鼠样品进行细胞融合筛选实验。

    • 细胞融合12 d后A-6、B-4、B-6三只小鼠细胞融合板出现阳性细胞融合孔55孔,融合阳性率1.64%。复检后有B-4、B-6两只小鼠共21个阳性细胞融合孔。对21个阳性细胞融合孔的样品进行针对萘和2-萘丁酸的ELISA实验,结果显示B-6小鼠的编号为1F2、1H10、2D10、3C6、3C7五个杂交瘤细胞阳性孔对萘有明显的抑制效果,能分泌抗萘单克隆抗体,选取这5个杂交瘤细胞阳性孔进行亚克隆和细胞建株。

    • 5株细胞第三轮亚克隆后阳性率均达到100%,取5个单克隆细胞进行24孔扩大培养后转T75方瓶培养、建株、冻存。

      对5株细胞株进行细胞上清液效价检测,其P/N值如表 3所示。

      表 3  细胞株上清效价测定(P/N)

      Table 3.  Cell line supernatant titer (P/N)

      可知5株细胞株的血清效价最高均能达到1: 15625以上。进一步对细胞株上清液进行针对萘和2-萘丁酸的ELISA实验,竞争抑制效果如图 3所示。

      图  3  杂交瘤细胞株间接竞争ELISA

      Figure 3.  Indirect competitive ELISA in thehybridoma cells strain

      可见所获得的5株杂交瘤细胞株对萘和2-萘丁酸的抑制效果均达到了50%以上,可以判断这5株杂交瘤细胞株均能分泌针对萘和2-萘丁酸的特异性抗体。

      对细胞株进行单克隆抗体亚型鉴定结果如表 4所示。

      表 4  单克隆抗体亚型鉴定

      Table 4.  The subtype of McAb

      对比不同亚型的检测结果, 从表 4中可以看出, 细胞株B01、B02、B03、B04、B05分泌的单抗亚型均为IgG1,kappa轻链。鼠源单抗亚型包括6种(IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgA), 其中最适合建立免疫学检测方法的亚型为IgG类,本实验获得的细胞株分泌的抗体适用于进行针对萘的免疫学检测研究。

    • 萘化合物作为小分子物质,且本身为双苯环结构,不具备碳链连接臂,在小分子物质人工抗原合成实验中很难直接偶联大分子蛋白质制备人工抗原。本研究结合半抗原的设计、修饰和人工抗原制备的研究现状,小分子物质碳链连接臂一般选择3~5个碳链长度为最佳,并最好有活性基团[19-20],故以丁酸作为修饰萘的碳链连接臂,选择2-萘丁酸作为半抗原。

      在小分子物质的人工抗原制备中,载体蛋白不仅可以增加半抗原的相对分子质量,还可以帮助促进诱导基体产生免疫应答反应,进而促进半抗原分子在免疫机体内的识别,常见的载体蛋白有牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)等,其中KLH因其与脊椎动物的免疫系统异源,被本课题选其为优先偶联载体蛋白。

    • 本实验选用的KLH是从软体动物Megathura crenuLata中分离出来的, 含有大量的一级氨基可用于有效结合半抗原, 作为免疫原可能引起的免疫反应比BSA和OVA强。且OVA与KLH的亲源关系较远, 交叉反应程度很低, 因此选用OVA作为包被原载体蛋白, 可以最大程度地避免非特异性交叉反应。

      两种不同配比的碳二亚胺法均成功的使2-萘丁酸-KLH偶联比达到小分子与载体蛋白的最适偶联率区间1: 10~1: 20。并有效刺激机体产生免疫应答,使得实验小鼠均产生免疫反应并获得了良好的免疫效果。

    • 两组共12只实验小鼠经4轮免疫之后, 抗血清效价最高均达到了1: 80000, 符合细胞融合和单克隆抗体的制备条件。细胞融合后, 经过HAT杂交瘤细胞筛选法和间接竞争ELISA法筛选出特异性符合要求的阳性细胞孔,并以这些阳性孔为目标进行亚克隆, 筛选出符合分泌抗萘单克隆抗体的细胞。对3次亚克隆后的细胞再次间接竞争ELISA法筛选特异性符合要求的细胞, 以防止具备分泌特异性抗体的杂交瘤细胞特性丢失。细胞融合到第一次亚克隆的时间应在14 d以内,否则非特异性细胞就有可能抑制分泌抗萘单克隆抗体杂交瘤细胞的生长, 最后可能导致阳性杂交瘤细胞特性丢失。

    • (1) 以丁酸为碳链连接臂的2-萘丁酸可以作为抗萘单克隆抗体制备的半抗原。

      (2) 本实验的B方案碳二亚胺法偶联的人工抗原偶联比介于1: 10~1: 20之间,偶联效果较好,且免疫性能稳定性较佳。

      (3) 本实验获得5株能稳定分泌抗萘单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 细胞株上清液抗体效价达到了1: 15625,抗体亚型均为IgG1,kappa轻链。适用于ELISA试剂盒以及萘的GICA试纸条的开发。

      (4) 本实验成功获取到的目标杂交瘤细胞株,为后续针对海洋环境中的盐度、各种离子等会干扰免疫检测方法建立的更严格的筛选提供实验基础,为海洋环境中萘的免疫学快速检测相关研究提供研究基础。本课题组还将按照类似实验条件对其余PAHs的单克隆抗体制备、快速检测ELISA试剂盒及胶体金免疫层析快速检测试纸条的开发进行深入研究。构建完整的针对海洋原油泄露导致的多环芳烃污染的快速检测方案。

参考文献 (20)

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