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眼点拟微球藻和近头状伪蹄型藻对抗生素的生理响应及去除效应

陈辉 刘珊 郝勤伟 徐向荣

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眼点拟微球藻和近头状伪蹄型藻对抗生素的生理响应及去除效应

    作者简介: 陈辉(1986-), 男, 湖南娄底人, 博士, 主要从事有机污染物的分布特征及生态效应评估, E-mail:chenhui20003@163.com;
    通讯作者: 徐向荣(1973-), E-mail:xuxr@scsio.ac.cn
  • 基金项目: 国家自然科学基金项目面上项目(51378488);广州市科技计划项目(201510010031)
  • 中图分类号: Q178.53

Physiology responses of Nannochloropsis oculata and Pseudokirchneriella subcapitata to antibiotic pollution and their removal effects

  • 摘要: 抗生素的广泛使用对水生生态环境造成潜在风险。为探讨水体残留抗生素对藻类的毒性作用,分别以海洋微藻眼点拟微球藻和淡水微藻近头状伪蹄型藻为对象,探讨三种典型抗生素(红霉素、诺氟沙星和磺胺嘧啶)胁迫下藻类的生理响应和去除效应。实验结果显示,三种抗生素中红霉素的毒性较强。高浓度红霉素对两种藻类生长均起到抑制作用,低浓度红霉素暴露则会刺激藻类生长,眼点拟微球藻和近头状伪蹄型藻的72 h半数最大有效浓度(EC50)分别为6.13 mg/L和27.7 μg/L。随着红霉素浓度的增加,两种藻类的光合色素含量显著降低(p < 0.05)。藻体内超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性也表现出低浓度红霉素暴露时显著增强,高浓度时则显著受到抑制的现象(p < 0.05)。实验结果表明所选藻类对诺氟沙星和磺胺嘧啶具有一定的生物去除能力。经144 h暴露后,眼点拟微球藻对诺氟沙星和磺胺嘧啶的去除率分别为57%和78.3%,近头状伪蹄型藻在暴露120 h后对诺氟沙星和磺胺嘧啶的去除率分别为51.2%和8.3%。
  • 图 1  红霉素对近头状伪蹄型藻和眼点拟微球藻生长率的影响

    Figure 1.  Effect of different concentrations of erythromycin on the growth rate of P.subcapitata and N.oculata

    图 2  红霉素对近头状伪蹄型藻和眼点拟微球藻的抑制率

    Figure 2.  Effect of different concentrations of ETM on the inhibition rate of P.subcapitata and N.oculata

    图 3  红霉素对眼点拟微球藻光合色素的影响

    Figure 3.  Effect of different concentrations of ETM on the photosynthetic pigment contents of N.oculata

    图 4  红霉素对近头状伪蹄型藻光合色素的影响

    Figure 4.  Effect of different concentrations of ETM on the photosynthetic pigment contents of P.subcapitata

    图 5  红霉素对眼点拟微球藻MDA、CAT和SOD的影响

    Figure 5.  Effects of ETM on the content of lipid peroxides (MDA), enzyme activities of catalase N.oculata

    图 6  红霉素对近头状伪蹄型藻MDA、CAT和SOD的影响

    Figure 6.  Effects of ETM on the content of MDA, enzyme activities of CAT and SOD of P.subcapitata

    图 7  诺氟沙星和磺胺嘧啶的藻类去除动力学

    Figure 7.  Removal dynamics of norfloxacin and sulfadiazine by N.oculata and P.subcapitata

    表 1  眼点拟微球藻和近头状伪蹄型藻对诺氟沙星和磺胺嘧啶去除动力学及其理化性质

    Table 1.  Physicochemical properties and removal kinetic parameters of norfloxacin and sulfadiazine by N.oculata and P.subcapitata

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出版历程
  • 收稿日期:  2018-06-11
  • 录用日期:  2018-09-18
  • 刊出日期:  2020-02-20

眼点拟微球藻和近头状伪蹄型藻对抗生素的生理响应及去除效应

    作者简介:陈辉(1986-), 男, 湖南娄底人, 博士, 主要从事有机污染物的分布特征及生态效应评估, E-mail:chenhui20003@163.com
    通讯作者: 徐向荣(1973-), E-mail:xuxr@scsio.ac.cn
  • 1. 中国科学院南海海洋研究所 热带海洋生物资源与生态重点实验室, 广东 广州 510301
  • 2. 中国科学院大学, 北京 100049
基金项目: 国家自然科学基金项目面上项目(51378488);广州市科技计划项目(201510010031)

摘要: 抗生素的广泛使用对水生生态环境造成潜在风险。为探讨水体残留抗生素对藻类的毒性作用,分别以海洋微藻眼点拟微球藻和淡水微藻近头状伪蹄型藻为对象,探讨三种典型抗生素(红霉素、诺氟沙星和磺胺嘧啶)胁迫下藻类的生理响应和去除效应。实验结果显示,三种抗生素中红霉素的毒性较强。高浓度红霉素对两种藻类生长均起到抑制作用,低浓度红霉素暴露则会刺激藻类生长,眼点拟微球藻和近头状伪蹄型藻的72 h半数最大有效浓度(EC50)分别为6.13 mg/L和27.7 μg/L。随着红霉素浓度的增加,两种藻类的光合色素含量显著降低(p < 0.05)。藻体内超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性也表现出低浓度红霉素暴露时显著增强,高浓度时则显著受到抑制的现象(p < 0.05)。实验结果表明所选藻类对诺氟沙星和磺胺嘧啶具有一定的生物去除能力。经144 h暴露后,眼点拟微球藻对诺氟沙星和磺胺嘧啶的去除率分别为57%和78.3%,近头状伪蹄型藻在暴露120 h后对诺氟沙星和磺胺嘧啶的去除率分别为51.2%和8.3%。

English Abstract

  • 受人为活动的影响,抗生素等污染物在自然环境中广泛存在,水环境已成为众多污染物集中的“汇”。藻类作为水体生态系统中的初级生产者,其结构或数量的变化都将影响更高营养级如浮游动物的生活状态。尽管抗生素的主要目标生物是微生物而不是藻类,但由于两者具有类似的组成结构(如线粒体)以及代谢途径,所以抗生素仍可能对藻类产生毒性作用。目前关于抗生素对藻类产生毒性已经有一些报道,研究结果表明绿藻对某些抗生素种类并不敏感[1]。另有研究发现在抗生素环丙沙星和磺胺甲恶唑暴露下,近头状伪蹄型藻的EC50值分别为3.0 mg/L和4.4 mg/L[2]。因此,考察抗生素对藻类生长、生理特性及种群变化的影响,探明抗生素影响藻类生长的作用机理,研究结果可为水体中抗生素的污染评价提供科学依据。

    另一方面,藻类在生长繁殖的过程中,能够吸收富集及代谢环境中的有机污染物,这些代谢物能转换为藻类生长所需的碳源、氮源及硫源。目前利用藻类去除水体中抗生素已经有了一些报道,如有研究利用普通小球藻在62 d去除了家畜养殖废水中69%的四环类抗生素[3]。铜绿微囊藻7 d去除了12.5%~32.9%的螺旋霉素和30.5%~33.6%的阿莫西林[4]。有研究表明利用小球藻可以去除头孢拉定,单独藻类处理时能将废水毒性从93%降至55%(基于轮虫的死亡率),再结合紫外光则能将废水毒性进一步降至23%。利用紫外光能有效降低废水中抗生素的毒性,可使藻类去除抗生素的过程在低毒性的环境中进行[5]。虽然目前已有研究报道了藻类对部分抗生素的去除情况,但关于藻类去除常见抗生素如磺胺类及喹诺酮类的研究仍非常有限。

    本研究选取水产养殖水体中常见抗生素磺胺嘧啶、诺氟沙星及红霉素作为研究对象,考察两种藻类(海洋微藻眼点拟微球藻和淡水微藻近头状伪蹄型藻),在不同浓度抗生素存在条件下的生长量、光合色素及丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)的活性变化。另外利用藻类对抗生素(基于生长抑制率)进行生物去除,计算获取其降解动力学方程,绘制降解动力学曲线。研究结果可为评价水体环境中残留抗生素的生态风险、探索残留抗生素的生物去除方法提供合理的科学依据。

    • 藻种为实验室保存的海水绿藻眼点拟微球藻(Nannochloropsis oculata)和淡水绿藻近头状伪蹄型藻(Pseudokirchneriella subcapitata)。海水藻培养基为F/2培养基,淡水藻使用BG11培养基。培养至对数生长期的藻液经离心后(5000 rpm,10 min)弃去上清液,浓缩的藻细胞先用灭菌后的Milli-Q水清洗两次,再用灭菌后相应的培养基重悬用于接种。

    • 磺胺嘧啶(梯希爱公司,上海),诺氟沙星(梯希爱公司,上海),色谱级甲酸(阿拉丁公司,上海),色谱级乙酸铵(梯希爱公司,上海),色谱级甲醇(Merck,德国);缓冲液:醋酸铵(2 mM)-甲酸(0.2%,v/v)缓冲液,称取0.154 g醋酸铵至1 L Milli-Q水中,溶解后再加入2 mL甲酸;500 ppm红霉素母液:称取0.5 g红霉素至10 mL甲醇中,保存于-20℃;500 ppm磺胺嘧啶母液:称取0.5 g磺胺嘧啶至10 mL甲醇中,保存于-20℃;500 ppm诺氟沙星母液:称取0.5 g诺氟沙星至10 mL混合液(9.875 mL甲醇与125 μL的1M的NaOH)中,溶解后-20℃保存。

    • 高效液相色谱HPLC(SHIMADZU,日本),酶标仪(thermo scientific microplate reader,USA),植物效率分析仪(handy PEA,hansatech instruments, Norfolk, UK),超纯水仪(Millipore,美国),移液枪(Eppendorf,德国),氮吹仪(organomation,美国),超净工作台(亚泰,江苏),超声仪(Elma,德国),恒温光照摇床(恒隆,上海)。

    • 在藻类毒性预实验中,分别考察了磺胺嘧啶、诺氟沙星和红霉素对藻类生长率的抑制情况。在浓度均为10 mg/L磺胺嘧啶、诺氟沙星和红霉素单独暴露条件下,眼点拟微球藻和近头状伪蹄型藻的生长抑制率分别为12%、8%、98%和18%、13%、90%,结果表明三种抗生素中红霉素对所选两种藻类的毒性最强。正式实验将考察这两种藻类对毒性较强的红霉素的生理生化响应,去除实验则考察两种藻类对毒性较弱的磺胺嘧啶及诺氟沙星的生物去除情况。

      在红霉素毒性实验中,先把红霉素标品配置成200 mg/L的储备液,然后稀释成不同浓度梯度备用。眼点拟微球藻的红霉素浓度范围为0.01~80 mg/L,按两倍稀释率设置10个浓度,近头状伪蹄型藻的红霉素浓度范围在2.4~1250 μg/L,按两倍稀释率设置10个浓度梯度。

      将预先培养好的藻类离心后弃去上清液,用灭菌后的Milli-Q水清洗两次,再用培养基重悬,用于接种。眼点拟微球藻和近头状伪蹄型藻初始接种密度分别为4.8×105 cells/mL和5.3×105 cells/mL。实验容器为250 mL摇瓶,培养箱温度设置为(24±1)℃,转速150 rpm,光强3000 lux,光暗周期比为12 h: 12 h。

    • 去除实验采用250 mL三角瓶,其中装100 mL的培养基(眼点拟微球藻使用F/2培养基,近头状伪蹄型藻使用BG11培养基)。实验中磺胺嘧啶和诺氟沙星的浓度为20 μg/L(取100 mL的含藻培养液,加入5 mg/L抗生素稀释液40 μL)。去除动力学实验包括活藻处理组(Nonsterile group)和灭活后死藻对照组(Sterile group),经预实验确定眼点拟微球藻的取样时间分别为0、4、8、16、48、96和144 h,近头状伪蹄型藻的取样时间分别为0、8、24、48、72、96和120 h。每个采样时间点分别在活藻组和对照组各取3个摇瓶作为3个平行样,经SPE提取后用以测定抗生素的含量,并绘制抗生素的去除曲线。

    • 培养3 d后,红霉素对两种藻类生长速率的影响如图 1所示。在不同浓度的红霉素培养条件下,近头状伪蹄型藻的生长速率存在显著差异。当红霉素浓度为2.44 μg/L时,近头状伪蹄型藻的生长速率与对照组没有显著差异,随着浓度不断升高,生长速率显著下降,表明红霉素对近头状伪蹄型藻毒性作用较强。在红霉素浓度范围为≤2.5 mg/L时,眼点拟微球藻的生长速率和对照组并无显著差异,但当红霉素浓度高≥5 mg/L时,其生长速率显著下降,浓度达到80 mg/L时,生长速率下降了近75%。以往研究表明,部分存在于水体中的抗生素对绿藻造成的毒性作用并不强烈,但红霉素等大环内酯类抗生素作为蛋白抑制剂对真核藻类存在较强毒性作用,模式生物近头状伪蹄型藻对红霉素的耐受性远低于眼点拟微球藻,相似的结果已有报道,如环丙沙星、磺胺嘧啶和螺旋霉素对近头状伪蹄型藻在72 h的EC50值分别为3.0 mg/L、7.8 mg/L和2.3 mg/L[6-7]。红霉素、环丙沙星和磺胺甲恶唑对近头状伪蹄型藻在72 h的EC50(半数最大有效浓度)值分别为0.20 mg/L、3.07 mg/L和4.40 mg/L[1]

      图  1  红霉素对近头状伪蹄型藻和眼点拟微球藻生长率的影响

      Figure 1.  Effect of different concentrations of erythromycin on the growth rate of P.subcapitata and N.oculata

      在低浓度红霉素暴露时,红霉素对两种藻毒性作用低表现为藻细胞数仍在增长,而高浓度红霉素可能对两种藻的光合作用等关键代谢途径产生了干扰,影响了藻类正常的代谢和繁殖,导致其生长受到抑制。在红霉素浓度分别为80 mg/L和1.25 mg/L条件下培养72 h,对两种藻类的抑制率分别达到了92%和83%。如图 2所示,近头状伪蹄型藻的NOEC(可观察无效应浓度)、LOEC(最低效应浓度)、EC50分别为1.2,2.4和27.7 μg/L。眼点拟微球藻的NOEC、LOEC和EC50值分别为0.25,0.5和6.13 mg/L。

      图  2  红霉素对近头状伪蹄型藻和眼点拟微球藻的抑制率

      Figure 2.  Effect of different concentrations of ETM on the inhibition rate of P.subcapitata and N.oculata

    • 光合色素(photosynthetic pigment)是指在光合作用中参与吸收、传递光能或引起原初光化学反应的色素。对于藻类这种光合自养生物来说,光合色素含量直接影响其光合作用的进行,从而对其进行有机物质(如蛋白质)合成造成影响。抗生素对藻类光合作用的影响主要在于中断或阻碍叶绿体基因表达、抑制或者加速叶绿素降解[8]

      本研究中不同浓度的红霉素对两种藻类光合色素的影响如图 3图 4所示。对眼点拟微球藻来说,当浓度低于5 mg/L时,拟微球藻的光合色素含量没有显著变化,但高浓度对光合色素产生显著影响;当浓度高于5 mg/L时,光合色素含量显著下降;但大于10 mg/L时光合色素含量并没有显著差别。当红霉素浓度为80 mg/L时,72 h后空白对照CA(叶绿素a)、CB(叶绿素b)、CT(总叶绿素)和CK(类胡萝卜素)分别下降了86%、80%、84%和74%。

      图  3  红霉素对眼点拟微球藻光合色素的影响

      Figure 3.  Effect of different concentrations of ETM on the photosynthetic pigment contents of N.oculata

      图  4  红霉素对近头状伪蹄型藻光合色素的影响

      Figure 4.  Effect of different concentrations of ETM on the photosynthetic pigment contents of P.subcapitata

      近头状伪蹄型藻比眼点拟微球藻敏感性更强,其光合色素含量呈现逐渐下降的趋势,当浓度达到0.625 mg/L和1.25 mg/L时,光合色素含量达到最低,此时红霉素浓度对光合色素没有显著影响。当浓度为1.25 mg/L时,72 h后对照空白CA、CB、CT和CK分别下降了61%、60%、61%和51%。结果表明低浓度红霉素暴露下,两种藻类的光合色素变化并不显著,但高浓度对藻类细胞结构产生了破坏,使得叶绿素含量降低,可能是藻细胞膜脂质的过氧化造成藻细胞和叶绿体结构的破坏,从而导致叶绿素合成受阻[9]。在植物叶绿素合成过程中有16种核基因编码的酶,红霉素对它们并无直接抑制作用,但因为这一过程中存在许多蛋白复合体是由核基因和叶绿素基因共同编码,所以互相之间协调表达对叶绿素的合成和保持非常重要,红霉素可以干扰PSII中诸如叶绿素a/b结合天线蛋白,导致叶绿素无法正常定位于类囊体膜上[10-11],而这些蛋白和叶绿素的正确定位相关,红霉素则可干扰其合成,使叶绿素无法正常定位于类囊体膜。

    • 眼点拟微球藻细胞中的脂质过氧化物(MDA)随着红霉素浓度升高表现出先增高后降低的趋势(如图 5)。低浓度红霉素条件下(0.25~0.5 mg/L),MDA含量在整个处理组中最低,表明藻类对红霉素有个适应过程。近头状伪蹄型藻MDA含量则随着红霉素浓度升高而持续增加,表明氧化胁迫和膜脂质过氧化现象的存在,由活性氧簇(ROS)引发的膜脂质过氧化会影响细胞膜的完整性,进一步导致细胞功能不可逆的损伤[12]。红霉素作为光合作用抑制剂,能阻断藻类PSII电子传递,从而使激发能无法从光反应中心色素(P680)向PSI传递,导致O2转换成ROS,造成氧化胁迫的产生。有研究报道,当植物暴露于含镉或吡氟禾草灵(新型除草剂)环境下,细胞中MDA含量升高[13]。本研究中,当红霉素浓度为10 mg/L时,MDA增长量达到最高(132%)。

      图  5  红霉素对眼点拟微球藻MDA、CAT和SOD的影响

      Figure 5.  Effects of ETM on the content of lipid peroxides (MDA), enzyme activities of catalase N.oculata

      随着红霉素浓度继续升高,MDA含量显著降低,这表明高浓度的红霉素可能对眼点拟微球藻细胞造成了损伤,超过了藻类的耐受范围。2015年Wan在研究红霉素对微囊藻毒性时同样发现在红霉素浓度为40 μg/L时,MDA含量较在30 μg/L时下降了1.5倍[14]。CAT和SOD也表现出与MDA类似的规律,在红霉素浓度为1~10 mg/L,两种酶活性显著增加,在红霉素浓度为10 mg/L时,CAT和SOD含量分别增加了91%和171%。近头状伪蹄型藻同样表现出随着红霉素浓度增加而酶活性增强的现象,当红霉素浓度范围分别为2.44~1250 μg/L和2.44~39.1 μg/L,SOD酶和CAT酶活性较空白对照组都显著增加,随着浓度升高虽然有下降趋势,但在红霉素浓度>312.5 μg/L时,SOD及CAT酶活性进一步增加。CAT作为一种抗氧化酶,能催化H2O2转化为H2O和O2,从而降低了H2O2对细胞的氧化压力,SOD同样也是保护植物细胞免受氧化损伤,催化O2-为H2O2和O2。在红霉素浓度不断升高的条件下,两种酶的含量也逐渐升高,说明红霉素对藻类产生氧化胁迫作用,导致了CAT和SOD酶的过量表达。

      有研究表明SOD酶的过量表达是植物叶绿体抵抗有机污染的方法[15]。当玉米暴露于有机磷农药环境中,其细胞中SOD酶和过氧物酶活性增加[16]。当红霉素浓度为20 mg/L时,CAT和SOD酶活性显著降低,这可能是由于H2O2的去除作用和H2O2的产生出现失衡,导致细胞中H2O2的大量增加。造成这一现象的原因是:(1)在高浓度的红霉素条件下,CAT和SOD酶活性无法激活或被高浓度红霉素所抑制,导致藻类无法清除细胞中H2O2[14];(2)细胞内ROS的积聚可能造成蛋白氧化同时导致CAT酶活性增加[17-18]。红霉素对近头状伪蹄型藻细胞MDA、CAT和SOD酶活性的影响如图 6

      图  6  红霉素对近头状伪蹄型藻MDA、CAT和SOD的影响

      Figure 6.  Effects of ETM on the content of MDA, enzyme activities of CAT and SOD of P.subcapitata

    • 在灭活的对照组中,磺胺嘧啶和诺氟沙星的含量在整个实验周期内均无明显损失(图 7),表明两种抗生素在藻细胞处理下的去除主要为生物去除,而非生物去除部分较少。两种抗生素的去除动力学参数如表 1所示,眼点拟微球藻对诺氟沙星及磺胺嘧啶的去除半衰期为6.23 d和2.60 d,近头状伪蹄型藻对诺氟沙星的去除半衰期为4.80 d,120 h后近头状伪蹄型藻对磺胺嘧啶的去除率<10%,仅为8.3%,表明近头状伪蹄型藻并不能有效去除磺胺嘧啶,而其在水体中生物去除的半衰期为115.5 d[19],有可能通过生物富集作用进入食物链对其他水生生物造成健康风险。

      图  7  诺氟沙星和磺胺嘧啶的藻类去除动力学

      Figure 7.  Removal dynamics of norfloxacin and sulfadiazine by N.oculata and P.subcapitata

      表 1  眼点拟微球藻和近头状伪蹄型藻对诺氟沙星和磺胺嘧啶去除动力学及其理化性质

      Table 1.  Physicochemical properties and removal kinetic parameters of norfloxacin and sulfadiazine by N.oculata and P.subcapitata

      两种抗生素在藻细胞作用下的生物去除均可用一级动力学方程进行拟合,拟合数据均具有良好的显著性(p<0.01)。如图 7所示,在眼点拟微球藻在培养144 h后对诺氟沙星和磺胺嘧啶的去除率分别为57.0%和78.3%;近头状伪蹄型藻在120 h对诺氟沙星的去除率为51.2%,近头状伪蹄型藻对磺胺嘧啶的去除效果则不明显。有研究指出利用Fe3+、草酸、小球藻在紫外光作用下去除水体中的磺胺嘧啶,去除动力学曲线符合一级动力学且拟合的r2值均在0.99以上[20]。藻类对两种抗生素的去除,可能是通过自身分泌作用形成小分子物质如溶解有机碳(DOC),DOC携带的大量官能团中,大多数是羧基团和酚式羟基基团,导致抗生素在光照条件下产生光解作用[21]

    • 本研究结果表明红霉素对眼点拟微球藻和近头状伪蹄型藻均有毒性作用,近头状伪蹄型藻的EC50值为27.7 μg/L,远低于眼点拟微球藻的EC50值6.13 mg/L,表明近头状伪蹄型藻对红霉素更为敏感。在红霉素浓度分别达到80 mg/L和1.25 mg/L条件下培养72 h后,对眼点拟微球藻和近头状伪蹄型藻的抑制率分别达到了92%和83%,显著影响了藻类细胞的正常生长。与近头状伪蹄型藻相比较,眼点拟微球藻对环境中的红霉素更为敏感。随着红霉素浓度的增加,藻细胞的光合色素显著降低,表明红霉素破坏了藻类的细胞结构。藻细胞中的脂质过氧化物(MDA)含量随着红霉素浓度升高表现为先增高后降低,表明其受到氧化胁迫,CAT酶和SOD酶活性随着红霉素浓度增加其活性也不断增强,但当红霉素达到一定浓度时,三种指标都出现下降的现象。眼点拟微球藻对诺氟沙星和磺胺嘧啶的去除率较好,在144 h去除率分别达到57.0%和78.3%,近头状伪蹄型藻在120 h对诺氟沙星的去除率达到51.2%,去除动力学均符合一级动力学方程。

参考文献 (21)

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