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不同粒径聚乙烯微粒对大型溞的生物毒性效应

巩宁 韩旭 李佳璠 邵魁双 廖秀睿 孙野青

引用本文:
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不同粒径聚乙烯微粒对大型溞的生物毒性效应

    作者简介: 巩宁(1975-), 辽宁沈阳人, 副教授, 研究方向为水生毒理学, E-mail:cospar06@dlmu.edu.cn;
    通讯作者: 邵魁双(1973-), 副研究员, 研究方向为海洋生态学, E-mail:ksshao@nmem.org.cn
  • 基金项目: 国家自然科学基金(41301560);国家重点研发计划项目(2016YFC1402104);中央高校基本科研业务费(3132019335)
  • 中图分类号: X171.5

Toxic effects of different particle size polyethylene microbeads on Daphnia magna

  • 摘要: 微塑料污染已经受到了国内外研究者的广泛关注,但研究热点多集中于海洋微塑料及其生物学效应,对淡水生物潜在影响的研究还很有限。本文选择淡水模式动物大型溞(Daphnia magna)作为受试生物,以2 μm、20 μm和50 μm聚乙烯微粒(polyethylene,PE)作为研究对象,探讨不同尺度微塑料对大型溞的急性活动抑制效应。结果表明,3种粒径的微塑料均可被大型溞摄入,并在肠道中积累,造成大型溞的活动抑制,并可能影响其脂类代谢;水中高浓度的PE微粒可粘附在大型溞体表,限制其活动,影响其摄食。在5~80 mg/L浓度范围内,2 μm PE微粒对大型溞的抑制率呈现线性增长趋势(96 h的EC50为50.86 mg/L);而20 μm和50 μm的PE微粒的抑制率随暴露浓度的增加呈现倒"U"形曲线。暴露48 h后,3种PE微粒的LOEC值分别为60、20和5 mg/L,即随粒径增大,毒性效应增加。粒径大小是影响大型溞摄入和积累微塑料的重要因素之一。本文结果为深入理解微塑料对淡水浮游动物的毒性效应提供了基础数据和理论依据。
  • 图 1  聚乙烯微粒的形态观察及其粒径分布

    Figure 1.  Morphologic observation and size distributions of PE microbeads

    图 2  三种粒径聚乙烯微粒暴露下大型溞的活动抑制

    Figure 2.  Inhibition rate of D.magna exposed to polyethylene particles

    图 3  20 mg/L不同粒径聚乙烯微粒暴露96 h大型溞肠道微塑料的积累

    Figure 3.  Accumulation of PE microbeads in the guts of D.magna after 96 h exposure

    图 4  暴露于80 mg/L不同粒径聚乙烯微粒96 h,大型溞体表附着的微塑料

    Figure 4.  Morphological observation of D.magna exposed topolyethylene particles (80 mg/L) for 96 h

    图 5  微塑料暴露组大型溞的“脂肪空泡”

    Figure 5.  "Fatty vacuolation" appeared in water fleas with PE particle exposure

    表 1  大型溞肠道内摄入微塑料的定性分析

    Table 1.  Qualitative analysis of the amount of microplastic in D.magna

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    表 2  三种粒径聚乙烯微粒的浓度对照

    Table 2.  Mass concentration and its corresponding particles concentration for PE microbeads

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    表 3  聚乙烯颗粒对大型溞活动抑制实验的回归分析

    Table 3.  Regression analysis for the results of OECD immobilisation test with PE particles on D.magna

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出版历程
  • 收稿日期:  2019-08-12
  • 录用日期:  2019-10-30
  • 刊出日期:  2020-04-20

不同粒径聚乙烯微粒对大型溞的生物毒性效应

    作者简介:巩宁(1975-), 辽宁沈阳人, 副教授, 研究方向为水生毒理学, E-mail:cospar06@dlmu.edu.cn
    通讯作者: 邵魁双(1973-), 副研究员, 研究方向为海洋生态学, E-mail:ksshao@nmem.org.cn
  • 1. 大连海事大学 环境科学与工程学院, 环境系统生物学研究所, 辽宁 大连 116026
  • 2. 国家海洋环境监测中心, 辽宁 大连 116023
基金项目: 国家自然科学基金(41301560);国家重点研发计划项目(2016YFC1402104);中央高校基本科研业务费(3132019335)

摘要: 微塑料污染已经受到了国内外研究者的广泛关注,但研究热点多集中于海洋微塑料及其生物学效应,对淡水生物潜在影响的研究还很有限。本文选择淡水模式动物大型溞(Daphnia magna)作为受试生物,以2 μm、20 μm和50 μm聚乙烯微粒(polyethylene,PE)作为研究对象,探讨不同尺度微塑料对大型溞的急性活动抑制效应。结果表明,3种粒径的微塑料均可被大型溞摄入,并在肠道中积累,造成大型溞的活动抑制,并可能影响其脂类代谢;水中高浓度的PE微粒可粘附在大型溞体表,限制其活动,影响其摄食。在5~80 mg/L浓度范围内,2 μm PE微粒对大型溞的抑制率呈现线性增长趋势(96 h的EC50为50.86 mg/L);而20 μm和50 μm的PE微粒的抑制率随暴露浓度的增加呈现倒"U"形曲线。暴露48 h后,3种PE微粒的LOEC值分别为60、20和5 mg/L,即随粒径增大,毒性效应增加。粒径大小是影响大型溞摄入和积累微塑料的重要因素之一。本文结果为深入理解微塑料对淡水浮游动物的毒性效应提供了基础数据和理论依据。

English Abstract

  • 由于价格低廉,延展性强,耐磨性好等优点,塑料制品被广泛的生产和使用。目前,全球的塑料年产量已超过3×108 t,并且正以0.2×108 t/a的速度增长[1]。塑料产品的大量使用以及废弃塑料的不当处理所带来的环境问题引起了人们的广泛关注。

    虽然陆地是塑料的生产源,但内陆水体和海洋才是数以万计的塑料垃圾的“汇”。据估算,全球海洋表面漂浮着超过2.5×105 t塑料垃圾[2]。塑料垃圾在海洋环流、光降解和微生物的共同作用下,被分解成粒径小于5 mm的塑料碎片,即为微塑料(microplastics,MPs)。相比大尺度塑料,微塑料在环境中的残留浓度更高,更容易被生物摄入。因此,微塑料被认为是一类重要的“新型污染物”而得到了越来越多的研究[3-4]。例如,Eriksen等[5]对南太平洋地区的微塑料污染进行了环境调查,发现微塑料丰度为26898.7 items/km2。Song等[6]对韩国南部海岸的微塑料分布做了相关的研究,发现100 μm以下的球状微塑料数量最多,丰度约为94±68 particles/L。我国的扬子江河口也检测出丰度为4137.3±2461.5 particles/m3的微塑料[7]

    除环境监测外,大量研究已经证实,水体中的微塑料可以被水生动物摄入,并对其产生胁迫作用。包括阻塞消化道、降低繁殖能力、产生氧化应激和炎症反应,甚至会转移至循环系统和淋巴系统等[8-12]。但总体来说,微塑料的环境监测及毒性效应研究仍处于起步阶段。相较于海洋微塑料研究,在淡水水系及淡水生物中的研究仍然比较匮乏,已发表的研究结果也不尽相同。例如,Ma等[13]用5种粒径(50 nm~10 μm)的微塑料对大型溞(Daphnia magna)进行48 h急性暴露,发现仅有纳米级微塑料产生了抑制作用。而Rehse等[14]的研究表明,1 μm的微塑料在浓度为12.5 mg/L时即对大型溞产生了活动抑制。另外,在繁殖抑制方面,不同研究者的数据之间也难以比较。如微米级微塑料暴露下大型溞(Daphnia magna),圆水溞(D.pulex)及网纹水溞(Ceriodaphnia dubia)的繁殖率降低[15];而另外的研究却发现,12.5 mg/L的微米级微塑料使大型溞的繁殖率显著增加[16]。我们认为,上述结果的不确定性与多种因素有关。其中,所使用的微塑料在形状、尺寸、化学性质及暴露浓度等方面的差异都是可能的原因。因此,不同类型微塑料对浮游动物的生物学效应研究还需要进一步开展。

    本文以淡水模式生物大型溞为受试对象,在其摄食的适口范围内(0.7~70 μm)[17],选择3种不同粒径范围的聚乙烯微粒,利用国际经合组织水溞活动抑制方法(OECD 202)[18],研究微塑料暴露对淡水浮游动物的生物学效应,探究尺度对大型溞摄入和积累微塑料的影响,以期为深入理解微塑料的环境效应提供基础数据。

    • 3种低密度聚乙烯微粒(polyethylene,PE)均购自Cospheric公司(https://www.cospheric.com/),粉末状,粒径范围分别为1~10 μm、10~22 μm和46~53 μm,密度均为0.96 g/cc。将3种粒径的PE微粒分别在光学显微镜下(Nikon 80i)进行观察及尺寸测定。每个粒径至少测量100个微粒,计算平均粒径及各粒径的微粒数。Tween-80购于上海生工工程有限公司,密度为1.095 g/L,为淡黄色至琥珀色油状液体。

    • 实验所用大型溞(D.magna)由大连海事大学环境系统生物学研究所培养。所用培养基为M4培养基,培养条件为20±1℃,光暗周期比为16 h: 8 h,每日投喂小球藻(Chlorella vulgaris)[投饵量为0.1 mg碳/(溞·d)], 每周更换1/3的M4培养基。实验动物为孤雌生殖3代以上的幼溞(< 24 h),活动正常且体型均匀的个体。

    • 用含有Tween-80(0.01%体积比)的M4培养基配制浓度为80 mg/L的PE储备液,在超声波清洗机(功率为40KHz)中超声分散60 min。再用M4培养基逐级稀释得到60、40、20、10和5 mg/L的暴露溶液。暴露前再次超声处理使溶液分散均匀。预实验结果表明,0.01%的Tween-80未对大型溞产生活动抑制。

      参照OECD 202实验方法[18],分别进行3种粒径范围的PE微粒对大型溞的活动抑制实验。每一个粒径下,分别设置6个浓度的(5、10、20、40、60和80 mg/L)暴露组和一个空白对照组。每个浓度设置3个平行实验组。将健康幼溞(< 24 h)随机放入100 mL烧杯中,每只烧杯中加入5只幼溞和50 mL测试液。暴露时间为96 h,暴露期间不喂食,不更换测试液。在暴露24、48、72和96 h后,分别记录幼溞的活动抑制率。按照OECD 202实验方法[18],轻轻晃动烧杯,15 s内大型溞不能游动,则认为活动被抑制。

    • 在急性暴露96 h后,将每个处理组的幼溞用玻璃吸管转移至清洁的载玻片上,在光学显微镜下(Nikon 80i,4×)观察并拍照,观察受到抑制的个体是否死亡,肠道内是否有PE微粒的积累及体表是否有PE微粒附着。采用定性的分析方法,对大型溞肠道内的PE微粒进行统计分析(表 1)。

      表 1  大型溞肠道内摄入微塑料的定性分析

      Table 1.  Qualitative analysis of the amount of microplastic in D.magna

    • 利用Excel 2010对数据进行统计处理。样本的组间差异采用t检验(T-test)及单因素方差分析(ANOVA)进行统计检验。p < 0.05时,为差异性显著;p < 0.01时,为极显著差异。采用实验法及概率单位法求得3种粒径PE颗粒对大型溞的最低可观察效应浓度(LOEC)及EC50值。

    • 图 1所示,3种粒径范围(1~10 μm、10~22 μm和46~53 μm)的PE微粒均为球形。平均粒径分别为1.86±0.44 μm、20±2.22 μm和51±2.27 μm。由其粒径分布可知(图 1A2图 1B2图 1C2),其主要微粒的粒径大小分别约为2 μm、20 μm和50 μm,因此,为叙述方便,下文分别简称为2 μm、20 μm和50 μm聚乙烯微粒。经计算可知,1 mg/L质量浓度下,3种粒径PE微粒的数量浓度分别为3×105 particles/mL、250 particles/mL和15 particles/mL。暴露实验中所用PE微粒的质量浓度与其相应的微粒数量浓度如表 2

      图  1  聚乙烯微粒的形态观察及其粒径分布

      Figure 1.  Morphologic observation and size distributions of PE microbeads

      表 2  三种粒径聚乙烯微粒的浓度对照

      Table 2.  Mass concentration and its corresponding particles concentration for PE microbeads

    • 作为淡水水体中广泛存在的浮游动物,大型溞以藻类为食,又可作为鱼类等的饵料,因此在水生食物链中占据重要的地位。研究表明,大型溞可以摄食粒径范围在0.7 ~ 70 μm的藻类[17]。因此,在其适口范围内,本文选择1 ~ 50 μm粒径范围内3种尺度的聚乙烯微粒,探讨粒径大小对微塑料生物毒性的影响。在暴露过程中,所有实验组大型溞均未发现死亡个体。空白对照组均未发现活动抑制个体。各处理组的活动抑制率及其回归分析分别如图 2表 3所示。

      图  2  三种粒径聚乙烯微粒暴露下大型溞的活动抑制

      Figure 2.  Inhibition rate of D.magna exposed to polyethylene particles

      表 3  聚乙烯颗粒对大型溞活动抑制实验的回归分析

      Table 3.  Regression analysis for the results of OECD immobilisation test with PE particles on D.magna

      在2 μm的PE微粒暴露下,大型溞的抑制率呈现出随暴露时间的延长及暴露浓度的增加而增大的趋势(图 2A图 2D)。暴露96 h后,EC50为50.86 mg/L(26.46~172.08 mg/L)。回归分析结果表明,在4个时间点(24、48、72和96 h),活动抑制率均随暴露浓度的增加而线性增加,并且随着暴露时间的延长,相同浓度下,抑制率逐渐增大(图 2D)。在20 μm的PE微粒暴露下,大型溞的活动抑制率随暴露浓度的增加呈现先增加再降低的趋势,即呈倒“U”形曲线(图 2B图 2E)。在40 mg/L及以下的暴露浓度中,随暴露浓度的升高,大型溞的活动抑制率增大,在40 mg/L微塑料暴露下达到最大值(33.33%)。在60和80 mg/L暴露组中,活动抑制率随浓度增加反而降低。除40 mg/L处理组外,其余浓度处理组均未表现出明显的时间效应关系。在50 μm的PE微粒处理下,暴露24 h后,5 ~ 40 mg/L的微塑料处理组大型溞即出现了活动抑制现象(抑制率在25%~40%之间);在暴露48 h后,所有微塑料暴露组均出现不同程度的活动抑制,在20 mg/L暴露组达到最高(55%)。回归分析表明,在24 h和48 h两个时间点,抑制率均呈现出随暴露浓度增加先升高再降低的趋势(图 2F表 3)。

      综上,3种不同粒径的PE微粒对大型溞的急性毒性效应呈现不同的抑制趋势。即随粒径增大,其浓度效应关系由线性增长转为先增加后降低的倒“U”形曲线。在暴露48 h,3种粒径PE微粒的LOEC值分别为60、20和5 mg/L,即随着粒径的增大,PE微粒对大型溞的急性毒性增强。

    • 在暴露96 h后,对对照组及暴露组的大型溞进行了光学显微镜下的形态学观察,每个处理组观察3~5个个体,结果如图 3图 4图 5所示。结果表明,与对照组相比,暴露组大型溞肠道中有不同程度的微塑料积累。在相同浓度(如20 mg/L)的PE微粒暴露下,随粒径增大,大型溞肠道中微塑料积累量增加,分别为肠道体积的1/4(+),1/2(++)和3/4(+++)(图 3)。在高浓度(80 mg/L)PE微粒暴露下,大粒径PE微粒组(20 μm和50 μm)大型溞肠道内的微塑料积累减少,但在体表可见明显的微塑料附着(图 4B图 4C)。该结果与活动抑制实验中大粒径PE颗粒组在高浓度暴露下活动抑制率下降的结果一致。

      图  3  20 mg/L不同粒径聚乙烯微粒暴露96 h大型溞肠道微塑料的积累

      Figure 3.  Accumulation of PE microbeads in the guts of D.magna after 96 h exposure

      图  4  暴露于80 mg/L不同粒径聚乙烯微粒96 h,大型溞体表附着的微塑料

      Figure 4.  Morphological observation of D.magna exposed topolyethylene particles (80 mg/L) for 96 h

      图  5  微塑料暴露组大型溞的“脂肪空泡”

      Figure 5.  "Fatty vacuolation" appeared in water fleas with PE particle exposure

      以上结果表明,溞龄 < 24 h的大型溞可以摄入粒径1 ~ 50 μm的聚乙烯微粒,并在肠道中积累。但不同粒径的微塑料在肠道中的积累过程不同,因此所引起的生物学效应也不尽相同。2 μm粒径的微塑料微粒与大型溞摄食的藻类大小最为接近[17],较易于被大型溞摄入。Rehse等[14]的研究也说明,1~4 μm的PE微粒可被大型溞摄入并引起活动抑制,而90~106 μm的微塑料则不能被大型溞摄入。同时,我们的前期研究结果表明,小尺度PE微粒可较快被大型溞清除(未发表数据),又因为本身体积较小,与大粒径微塑料相比,对大型溞消化道造成的阻塞作用较弱,因此所引起的活动抑制效应在暴露早期阶段并不明显。但随着暴露时间的延长及暴露剂量的增加,其对大型溞产生活动抑制效应也在不断增加。另外,不同粒径的微塑料在大型溞肠道中的停留时间也可能不同,因而可影响其在体内的积累。涂烨楠等[19]在对浮游动物摄食微塑料的研究过程中发现,大型溞对0.1 μm、1.0 μm和9.9 μm微球的平均排泄速率分别为8.2、7.8和3.4颗粒/min,即大型溞对较大粒径微塑料排泄速率最慢,因此毒性更高,该结果与本文结论一致。而Jeong等[20]在轮虫(Brachionus koreanus)中的研究发现,相对于6 μm的颗粒,0.05 μm和0.5 μm更难排出体外,导致较小粒径的微塑料呈现更强的毒性,与本文结果相反。可能的原因是本文使用的均为微米级颗粒,主要富集在肠道中,而更小尺度乃至纳米级的颗粒可能会转移到肝脏[9]和循环系统[10],从而导致较强的毒性。

      此外,20 μm和50 μm的微塑料对大型溞的活动抑制效应均表现出倒“U”形的曲线,即在低浓度时随浓度升高抑制率增大,在高浓度时随浓度升高抑制率降低。而镜检结果也表明,在这两个粒径的高浓度PE微粒暴露下,大型溞肠道中的PE微粒积累量较少。这一结果说明,PE微粒对大型溞产生活动抑制主要是由于肠道的阻塞作用引起的。当水层中微塑料浓度较低时(如20 mg/L),大型溞不断摄入微塑料并在肠道中积累,随暴露时间的延长及暴露浓度的增加而使肠道中微塑料不断增加,引起抑制率上升。而当暴露浓度增加时,水层中的微塑料数量也增多,部分微塑料微粒附着在大型溞体表,使大型溞的活动受限,滤食能力受到影响,肠道中积累的微塑料减少,活动抑制率反而降低。Ziajahromi等[21]研究表明,纤维状的微塑料会缠绕在大型溞的体表,降低大型溞的活动能力,从而减少了大型溞对微塑料的摄入。Rehse[14]的研究也表明,当水体中微塑料浓度达到400 mg/L时,1~4 μm的PE微粒对大型溞的活动抑制反而较浓度为200 mg/L时降低,即也呈现出抑制率随浓度先增加再降低的趋势。在96 h暴露下,PE微粒对大型溞的EC50为57.43 mg/L,与本文所得结果类似。上述结果均说明,随着水体中微塑料尺度的增加,倒“U”形曲线中达到抑制率最高点的微塑料浓度会逐渐降低,如20 μm的PE微粒暴露下,约在40 mg/L时抑制率最高,而50 μm的PE微粒暴露下,约在20 mg/L时抑制率最高(图 2表 3)。由此可知,浮游动物对微塑料的摄入及其在肠道中的积累,不仅可对动物造成物理性损伤,还可能由于体表粘附而使其活动受限,从而导致摄食减少、造成能量缺乏[21],进而引起生长、活动甚至繁殖能力的减弱[20],而给水生生态系统带来无法预知的风险。

    • 在微塑料暴露组中,我们发现大型溞肠道周围组织出现大小不等的油滴状颗粒(图 5B~图 5D)。在50 μm PE微粒暴露组中尤其明显(图 5D)。推测在肠道附近组织出现的颗粒为脂肪空泡(fatty vacuolation),可能与受试生物脂肪代谢异常有关,尚需进一步研究证实。类似的组织学改变在青鳉(Oryzias latipes)肝组织[22]、鲈鱼(Dicentrarchus labrax)和斑马鱼(Danio rerio)肠道中也有发现[23-24]。最近,Wang等[8]用10 μm聚苯乙烯(PS)暴露丰年虾幼体(Artemia parthenogenetica),在暴露24 h后发现肠道组织出现脂滴(lipid droplet)。作者认为脂滴是一种动态的细胞器,在调节细胞内能量产生、脂类代谢及膜的合成等方面起着重要的作用。PS暴露组中脂滴的增多可导致脂类代谢的异常及相关酶及膜蛋白的功能障碍。该结果与本文结果类似,说明微塑料对浮游动物的胁迫效应不仅体现在个体水平上,在组织、细胞层面及物质代谢、合成等方面上也可能产生影响,相关研究有待进一步证实。

    • (1) 大型溞可以摄入1 ~ 50 μm的PE微粒,PE微粒对大型溞的毒性效应随粒径的增大而增大。

      (2) 3种粒径PE微粒对大型溞的生物毒性均表现出时间-效应关系,随着暴露时间的延长,抑制率增加。

      (3) 3种粒径PE微粒对大型溞的活动抑制表现出不同的剂量-效应关系,平均粒径为2 μm的PE微粒的抑制率在5~80 mg/L浓度范围内呈线性增长;而平均粒径为20 μm和50 μm的PE微粒的抑制率则呈现倒“U”形的曲线,即低浓度随浓度增加抑制率增大,在高浓度随暴露浓度的增加抑制率降低。

      (4) 微塑料在肠道内的积累是导致大型溞活动抑制的主要原因。

参考文献 (24)

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