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  • ISSN 1007-6336
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放射性核素137Cs、90Sr对半滑舌鳎肝脏细胞氧化应激毒性的研究

高会 李瑞婧 杜金秋 姚子伟

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放射性核素137Cs、90Sr对半滑舌鳎肝脏细胞氧化应激毒性的研究

    作者简介: 高会(1985-), 女, 辽宁大连人, 硕士, 主要研究方向为污染物环境行为, E-mail:hgao@nmemc.org.cn;
    通讯作者: 姚子伟(1973-), 男, 辽宁大连人, 博士, 主要研究方向为污染物环境行为, E-mail:zwyao@nmemc.org.cn
  • 基金项目: 国家自然科学基金(41406088,21377032);国家海洋局近岸海域生态环境重点实验室基金(201506)
  • 中图分类号: X171.5

Oxidative stress toxicity effects of radioactive nuclide 137Cs、90Sr on liver cells of Cynoglossus Semilaevis

  • 摘要: 以半滑舌鳎肝脏细胞(HTLC)为研究对象,利用噻唑蓝比色法(MTT)、乳酸脱氢酶(LDH)、活性氧自由基(ROS)和超氧化物歧化酶(SOD)等方法分析细胞活性、细胞膜完整程度以及氧化应激反应相关指标,探究海洋环境中放射性核素137Cs、90Sr的生物毒性效应。HTLC细胞活性随137Cs、90Sr活度升高呈先增加后降低的趋势,且在低活度核素作用下,细胞活性增加极其显著(p < 0.01),137Cs对细胞膜无损伤,90Sr则使细胞膜损伤显著(p < 0.05),但二者均能使ROS含量和SOD活性显著性增加(p < 0.05)。高活度核素作用下SOD活性均显著增加(p < 0.05),但137Cs作用时ROS无显著变化,90Sr则使ROS显著增加(p < 0.05)。研究表明,在本实验活度条件下,137Cs和90Sr对海洋鱼类细胞无显著的生物毒性,细胞能够通过自我调节维持正常功能。90Sr能产生氧化应激反应,对膜系统造成损伤,可能影响细胞多种代谢途径,对生物体具有潜在的毒性效应。
  • 图 1  不同活度137Cs和90Sr对HTLC细胞活性的影响

    Figure 1.  The effects of 137Cs and 90Sr with different activities on HTLC activity

    图 2  不同活度137Cs和90Sr对HTLC细胞LDH漏出率的影响

    Figure 2.  The effects of 137Cs and 90Sr with different activities on the LDH leakage rate in HTLC

    图 3  不同活度137Cs和90Sr对HTLC细胞ROS含量影响

    Figure 3.  The effects of 137Cs and 90Sr with different activities on the content of ROS in HTLC

    图 4  不同活度137Cs和90Sr对HTLC细胞SOD活性影响

    Figure 4.  The effects of 137Cs and 90Sr with different activities on SOD activity in HTLC

    图 5  137Cs和90Sr作用下HTLC细胞氧化应激反应示意图

    Figure 5.  The oxidative stress progress in HTLC with 137Cs and 90Sr exposure

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出版历程
  • 收稿日期:  2018-11-12
  • 录用日期:  2019-04-18
  • 刊出日期:  2020-06-20

放射性核素137Cs、90Sr对半滑舌鳎肝脏细胞氧化应激毒性的研究

    作者简介:高会(1985-), 女, 辽宁大连人, 硕士, 主要研究方向为污染物环境行为, E-mail:hgao@nmemc.org.cn
    通讯作者: 姚子伟(1973-), 男, 辽宁大连人, 博士, 主要研究方向为污染物环境行为, E-mail:zwyao@nmemc.org.cn
  • 国家海洋环境监测中心, 辽宁 大连 116023
基金项目: 国家自然科学基金(41406088,21377032);国家海洋局近岸海域生态环境重点实验室基金(201506)

摘要: 以半滑舌鳎肝脏细胞(HTLC)为研究对象,利用噻唑蓝比色法(MTT)、乳酸脱氢酶(LDH)、活性氧自由基(ROS)和超氧化物歧化酶(SOD)等方法分析细胞活性、细胞膜完整程度以及氧化应激反应相关指标,探究海洋环境中放射性核素137Cs、90Sr的生物毒性效应。HTLC细胞活性随137Cs、90Sr活度升高呈先增加后降低的趋势,且在低活度核素作用下,细胞活性增加极其显著(p < 0.01),137Cs对细胞膜无损伤,90Sr则使细胞膜损伤显著(p < 0.05),但二者均能使ROS含量和SOD活性显著性增加(p < 0.05)。高活度核素作用下SOD活性均显著增加(p < 0.05),但137Cs作用时ROS无显著变化,90Sr则使ROS显著增加(p < 0.05)。研究表明,在本实验活度条件下,137Cs和90Sr对海洋鱼类细胞无显著的生物毒性,细胞能够通过自我调节维持正常功能。90Sr能产生氧化应激反应,对膜系统造成损伤,可能影响细胞多种代谢途径,对生物体具有潜在的毒性效应。

English Abstract

  • 在能源紧缺的大环境下,核能作为可持续发展的清洁能源备受瞩目。世界上核电站大部分位于沿海区域,除了利用海水进行循环冷却外,海洋对于放射性废水的稀释作用也是重要因素之一,由此也导致了核电站周边水体、沉积物、土壤、生物体等多介质中仍能检测到一定量的放射性核素残留[1-3]。1986年苏联切尔诺贝利事故和2011年日本福岛核电站事故,释放出的大量放射性核素,包括110mAg,134Cs,137Cs,131I,89Sr,90Sr等核素。1997年和1998年的第二次全国污染调查表明[4-5],我国海洋主要的人工放射性核素是137Cs和90Sr,而放射性核素中危害较大的正是锶、铯。90Sr能够通过空气和食物对人体产生内照射(β射线),半衰期较长,为28 a,且产生量巨大;而137Cs是一种核裂变产物,又称人工放射性核素[6],在物理性质上既是γ发射体,同时又是β发射体,半衰期长达30.17 a,依据其危险性和危害性被称之为生物关键核素[7]。进入海洋环境中的放射性核素在鱼和其他生物体内富集,并通过食物链传递最终进入人体,危及人体健康。

    据研究报道,137Cs作用于雄性小鼠,可诱发氧化应激反应,导致小鼠肾脏和肝脏损伤[8]90Sr作用于年轻大鼠50 d,导致其胫骨组织发生变化,如骨骺线破坏,骨硬化,骨小梁无菌性坏死以及骨髓元件受抑等[9]。Van等[10]研究发现,体内注射90Sr可缩短雌性小鼠寿命,增加骨肿瘤发生几率。137Cs和90Sr作为代表性人工放射性核素,关于其在近岸海洋环境中的生物毒性研究明显不足。

    以往研究均局限于外照射探索放射性核素的毒性效应,并不能真实反映海洋环境中放射性核素的生物毒性危害。半滑舌鳎属于海洋鱼类,终年生活栖息在中国近海海区,已经经人类驯化后成为人们生活中常见的食用鱼。鱼类肝脏作为污染物在鱼体内主要的富集场所、同时也是生物体主要的解毒器官,且体外细胞具有稳定性和对污染物敏感性高的特点,本研究选取半滑舌鳎肝脏细胞(HTLC)为受试对象,研究137Cs和90Sr对细胞活性及细胞器损伤影响,揭示在氧化应激反应下137Cs和90Sr的致毒过程,进一步为海洋放射性污染物的环境风险评估和海洋生物食用安全性评估提供科学依据。

    • 仪器:XD-202型荧光倒置显微镜(江南永新光学有限公司,南京),374型荧光酶标仪(Thermo,美国),Model 680型酶标仪(Biorad,美国),细胞培养箱(一恒科技有限公司,上海)。

      试剂:青链霉素抗体、四甲基偶氮噻唑蓝MTT(北京索莱宝科技有限公司),137Cs和90Sr标准溶液(纯度99.99%,中国计量科学院),DMEM-F12培养基(Thermo,美国),胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司),成纤维生长因子bFGF (PeproTech,美国),SOD试剂盒、ROS试剂盒和LDH试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

    • 半滑舌鳎肝脏细胞(HTLC)受赠于任国诚[11]实验室。将细胞置于含15%胎牛血清、1%青链霉素抗体、1%bFGF的DMEM-F12培养基中于24℃细胞培养箱中培养。

    • 本实验依据党红蕾等[12]操作方法,配置活度为1 Bq/mL的137Cs和90Sr标准品母液,逐级稀释至实验所需活度。将长势良好的HTLC细胞接种于96微孔板中,接种密度为2×105 cells/mL,每孔100 μL。24 h后移出旧培养基,加入含不同活度137Cs和90Sr(0、0.0001、0.001、0.01 Bq/mL)标准培养基。每个实验活度包括6个平行,继续于24 ℃培养24 h。染毒结束后,每孔加20 μL MTT(5 mg/mL)溶液,孵育4 h,再加入150 μL DMSO,振荡10 min,用酶标仪在490 nm下测定吸光值。

    • 运用乳酸脱氢酶试剂盒测定细胞培养液上清和细胞内液LDH活性。137Cs和90Sr(0、0.0001、0.001、0.01 Bq/mL)染毒24 h后离心,收集细胞上清液,于-20 ℃保存待测。加入含血清培养基重悬细胞沉淀,经反复冻融后使细胞膜破裂,再次离心收集细胞内液,于-20 ℃保存待测。每组实验设定3个平行。实验方法参照LDH试剂盒。

      利用以下公式计算各实验组的LDH漏出率。

    • 利用化学荧光法和四唑盐WST-1法检测细胞内ROS的含量和SOD的活性。137Cs和90Sr(0、0.0001、0.001、0.01 Bq/mL)染毒24 h后收集细胞,PBS重悬沉淀,细胞浓度达到105 cells/mL,每组实验设定3个平行。实验方法参照ROS、SOD试剂盒。

    • 实验数据的分析采用SPSS 19.0软件,各组数据平均值和标准差(X±S)计算使用Excel软件,阴性对照组与染毒组之间的差异采用单因素ANOVA分析和t检验进行比较(*p < 0.05差异显著,**p < 0.01差异极显著)。

    • 在检测137Cs和90Sr细胞毒性的MTT实验中,90Sr活度为0.0001、0.001、0.01 Bq/mL的染毒组与阴性对照组相比细胞活性均具有极显著差异(p < 0.01),137Cs活度为0.0001、0.001 Bq/mL时染毒组与阴性对照组相比细胞活性均具有显著差异(p < 0.05)(图 1),可见二者均对细胞活力无显著抑制作用。而且,随着137Cs和90Sr的活度升高,HTLC细胞活性均呈现先增加后降低的趋势。

      图  1  不同活度137Cs和90Sr对HTLC细胞活性的影响

      Figure 1.  The effects of 137Cs and 90Sr with different activities on HTLC activity

    • LDH是胞内酶,当细胞膜破损后会漏出胞外。收集细胞培养上清液作为胞外液,细胞经反复冻融后上清液作为胞内液,按照LDH试剂盒测得各实验组胞内外LDH活性,二者相加即为胞内外LDH活性总和。

      LDH漏出率结果如图 2所示,90Sr在活度为0.0001 Bq/mL时使LDH漏出率显著增加,137Cs则在同一活度下使LDH漏出率显著降低,表明低活度90Sr能破损细胞膜,而低活度137Cs下细胞大量增殖,使胞内LDH比例增加,漏出率减小。

      图  2  不同活度137Cs和90Sr对HTLC细胞LDH漏出率的影响

      Figure 2.  The effects of 137Cs and 90Sr with different activities on the LDH leakage rate in HTLC

      137Cs发射高能光子,是在人体和其他物种中造成遗传剂量的一个潜在的重要核素,分布在人体内全身肌肉和肝中,不易排出体外[13]90Sr属于高毒性核素,能够沉积在含钙的骨组织并保留多年,且具有潜在的内辐射危害性[14]。本研究中90Sr诱导HTLC细胞膜破损,表明90Sr能攻击细胞膜中多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应,导致细胞膜出现破损,胞内酶LDH漏到胞外。Zhang等[15]研究证实六溴环十二烷可以通过脂质过氧化反应,导致细胞膜损坏,LDH漏出胞外。

    • 不同活度137Cs和90Sr作用HTLC细胞,细胞内ROS含量变化情况见图 3。HTLC细胞内ROS含量随137Cs和90Sr活度增加而先升高后降低。与阴性对照组相比,HTLC细胞内ROS含量在137Cs活度0.0001、0.001 Bq/mL染毒组极显著升高(p < 0.01),在所有90Sr染毒组均极显著升高(p < 0.01)。而且,90Sr相比137Cs在HTLC细胞内诱导产生的ROS含量更高。该结果表明137Cs和90Sr均诱导HTLC细胞发生氧化应激反应。

      图  3  不同活度137Cs和90Sr对HTLC细胞ROS含量影响

      Figure 3.  The effects of 137Cs and 90Sr with different activities on the content of ROS in HTLC

    • ROS存在于细胞正常代谢过程中,其产生和清除处于一种动态平衡。SOD是清除ROS的典型抗氧化酶。137Cs和90Sr染毒后,HTLC细胞内SOD活性升高(图 4)。在染毒24 h时,90Sr染毒组中HTLC细胞内SOD活性与阴性对照组相比具有显著差异(p < 0.05),在137Cs染毒组中HTLC细胞内SOD活性与阴性对照组相比则具有极显著差异(p < 0.01)。此外,HTLC细胞表现出明显的剂量依赖效应,说明在氧化应激过程中,SOD起到了清除HTLC细胞内自由基的作用。

      图  4  不同活度137Cs和90Sr对HTLC细胞SOD活性影响

      Figure 4.  The effects of 137Cs and 90Sr with different activities on SOD activity in HTLC

      若SOD不能将ROS完全清除,细胞则已经产生氧化应激反应[16],过量ROS攻击细胞内脂类、蛋白质、核酸等生物大分子,引起线粒体、内质网肿胀和脂质过氧化反应,从而使细胞正常代谢紊乱并诱发细胞凋亡[17]

      本研究(图 5)中SOD含量随137Cs和90Sr活度增加而增加,ROS则呈现升高后降低的趋势,可见SOD能够有效清除HTLC细胞内ROS,使其恢复正常水平。此外,137Cs并未导致细胞膜破损,且反应产生的ROS经过SOD清除之后恢复到阴性对照的水平,可见137Cs与90Sr相比细胞毒性更小。90Sr虽对HTLC细胞内产生了氧化应激作用,导致细胞膜破损,但随着SOD等抗氧化应激机制的响应,90Sr并未显著影响细胞增殖率及活力。因此,实验活度下HTLC细胞通过自我调节作用能够恢复正常细胞功能。

      图  5  137Cs和90Sr作用下HTLC细胞氧化应激反应示意图

      Figure 5.  The oxidative stress progress in HTLC with 137Cs and 90Sr exposure

      放射性核素在生物体内具有富集作用,虽然在环境活度水平下的放射性元素尚不能影响细胞活力,但当生物体内放射性核素积累到一定水平时则可能危害生物体健康。因此,放射性核素长期作用对生物体的危害仍然不容忽视。

    • (1) 低活度(0.0001、0.001 Bq/mL)放射性核素137Cs和90Sr能显著促进HTLC细胞活性增长,同时诱导氧化应激反应,产生大量ROS,对细胞具有潜在毒性效应。

      (2) 低活度90Sr能够破坏细胞膜,影响细胞多种代谢途径,对生物体产生毒性效应,137Cs对细胞膜无显著损伤作用,细胞能够通过启动ROS清除机制,维持正常功能。

参考文献 (17)

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