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湿地甲烷代谢微生物产甲烷菌和甲烷氧化菌的研究进展

李思琦 臧昆鹏 宋伦

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湿地甲烷代谢微生物产甲烷菌和甲烷氧化菌的研究进展

    作者简介: 李思琦(1993-), 女, 辽宁沈阳人, 博士研究生, 主要研究方向为微生物分子生态学, E-mail:lisiqi.sy@outlook.com;
    通讯作者: 宋伦, 研究员, E-mail:785020725@qq.com
  • 基金项目: 辽宁省重点研发计划项目(2018228004);辽宁省海洋与渔业科研项目(201828)
  • 中图分类号: Q938.1

Review on methanogens and methanotrophs metabolised by methane in wetland

  • 摘要: 湿地作为一种独特的生态系统,是大气中重要温室气体甲烷(CH4)的"源",湿地CH4的排放是CH4的产生、传输和氧化三个过程的最终结果,其排放量与产甲烷菌(methanogens)和甲烷氧化菌(methanotrophs)的活动密切相关。本文对湿地甲烷代谢重要微生物产甲烷菌和甲烷氧化菌的分类、特点、代谢途径、分子生态学研究现状及影响湿地产甲烷菌和甲烷氧化菌的重要环境因子等方面进行了综述,旨在促进我国湿地产甲烷及甲烷氧化菌群的领域更加系统和深入的研究,为有效调控湿地CH4代谢,减少CH4排放通量提供参考。
  • 表 1  产甲烷菌的分类

    Table 1.  Taxonomy of methanogens

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    表 2  不同代谢类型产甲烷菌的典型反应式

    Table 2.  Typical organisms of methanogenesis reactions

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    表 3  甲烷氧化菌的分类

    Table 3.  Taxonomy of methanotrophs

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出版历程
  • 收稿日期:  2018-11-26
  • 录用日期:  2019-01-08
  • 刊出日期:  2020-06-01

湿地甲烷代谢微生物产甲烷菌和甲烷氧化菌的研究进展

    作者简介:李思琦(1993-), 女, 辽宁沈阳人, 博士研究生, 主要研究方向为微生物分子生态学, E-mail:lisiqi.sy@outlook.com
    通讯作者: 宋伦, 研究员, E-mail:785020725@qq.com
  • 1. 中国海洋大学 海洋生命学院, 山东 青岛 266100
  • 2. 国家海洋环境监测中心, 辽宁 大连 116023
  • 3. 辽宁省海洋水产科学研究院, 辽宁省海洋生物资源与生态学重点实验室, 辽宁 大连 116023
基金项目: 辽宁省重点研发计划项目(2018228004);辽宁省海洋与渔业科研项目(201828)

摘要: 湿地作为一种独特的生态系统,是大气中重要温室气体甲烷(CH4)的"源",湿地CH4的排放是CH4的产生、传输和氧化三个过程的最终结果,其排放量与产甲烷菌(methanogens)和甲烷氧化菌(methanotrophs)的活动密切相关。本文对湿地甲烷代谢重要微生物产甲烷菌和甲烷氧化菌的分类、特点、代谢途径、分子生态学研究现状及影响湿地产甲烷菌和甲烷氧化菌的重要环境因子等方面进行了综述,旨在促进我国湿地产甲烷及甲烷氧化菌群的领域更加系统和深入的研究,为有效调控湿地CH4代谢,减少CH4排放通量提供参考。

English Abstract

  • 湿地是一种多功能、过渡性的生态系统,介于陆地和水域生态系统之间,是人类生存和发展的重要自然资源,被称为“自然之肾”[1],在生态环境维护、气候调节、蓄洪防旱及促淤造陆等方面发挥着重要的作用。湿地占陆地总面积的5%~8%,但其碳储量却相当于陆地碳储总量的18%[2],释放的甲烷量约占全球甲烷排放总量的30%[3]。甲烷(CH4)是一种重要的温室气体,有研究表明,自工业革命以来,大气中CH4的浓度已从722 μg/L增至1830 μg/L,虽然其仅占全球人为温室气体年排放总量的16%,但其对温室效应贡献率高达30%,且大气中CH4的浓度以每年1.0%~1.2%的速度持续增长[4]。CH4的排放源主要包括人为源与自然源两种,其中湿地生态系统是CH4最大的自然排放源[5]。湿地是典型的无氧环境,湿地中植物根系代谢物或植物残体会释放、降解成产CH4过程的底物,这些为CH4的产生创造了有利条件。

    产甲烷菌和甲烷氧化菌是介导湿地CH4循环的重要功能菌群,产甲烷菌是一种广泛分布于厌氧环境的古菌,在有机物厌氧降解的最后一步将其转化为CH4。甲烷氧化菌以CH4为其唯一的碳源和能源进行同化和异化代谢[6],其生态分布广泛,对于减少大气CH4含量和减缓全球温室效应方面具有重要意义。在厌氧条件下,湿地CH4排放的三个基本过程为:湿地中产甲烷菌分解土壤中的有机质产生CH4,即CH4的产生;土壤氧化层以及根际中的部分CH4被甲烷氧化菌氧化,即CH4的氧化;CH4通过土壤、水体和植物体排入大气,即CH4的释放[7],湿地CH4排放量占全球CH4排放通量的20%~40%[8]。产甲烷菌和甲烷氧化菌都是湿地中重要的环境微生物菌群,在湿地CH4的平衡代谢及碳素循环过程中扮演着重要的角色。本文对当前湿地中产甲烷菌和甲烷氧化菌研究的发展、特点、代谢途径、研究技术手段及影响湿地CH4排放的因素进行了综述概括,并进行了研究展望。

    • Stephenson等[9]1933年在第一次得到了产甲烷菌的纯培养物,Bryant等在1974年首次提出“产甲烷菌”一词,1996年,第一株产甲烷菌DSM2661株基因组测序由美国伊利诺伊大学完成,这标志着产甲烷菌进入了分子生物学研究的新时代[10]。产甲烷菌属于古菌域(archaea)广古门菌门(euryarchaeota),1998年之前,学术界普遍认为产甲烷菌仅由5个目组成,即甲烷杆菌目(methanobacteriales)、甲烷球菌目(methanococcales)、甲烷微菌目(methanomicrobiales)、甲烷八叠球菌目(methanosarcinales)和甲烷火菌目(methanopyrales)。1998年,德国科学家在水稻土中发现了一类新的产甲烷菌,命名为RC-1株[11];2007年,日本研究者Sakai等[12]从水稻土壤中获得首个RC-1纯培养物,并确定其为一个新目,即甲烷胞菌目(methanocellales)。2012年,Dridi等[13]从人类粪便中分离获得了一个新型纯培养物,并正式提出第七产甲烷古菌目(methanomassiliicoccales)。至此产甲烷菌的分类中包含上述7个目[14-15](表 1)。

      表 1  产甲烷菌的分类

      Table 1.  Taxonomy of methanogens

    • 产甲烷菌是一种特殊的、现今已知的唯一一种在能量代谢过程产生CH4的原核生物。产甲烷菌的形态主要包括杆状、规则或不规则球状、螺旋状和八叠状等,其细胞壁由大量的杂多糖和蛋白质亚基组成,故产甲烷菌革兰染色既有阴性也有阳性,甚至在同一属内不同种之间也存在差别。产甲烷菌的生长条件较为苛刻,纯培养在曝氧条件下最多存活30 h,且生长繁殖十分缓慢。产甲烷菌广泛存在于湿地、湖泊、沼泽、水稻田、污泥和海底沉积物等自然环境中,反刍动物的瘤胃等生物体内,沼气反应器或生物反应池等人工生物降解设施中,水底热流、热泉或含硫热液口等极端环境中,深部油层和煤层等环境中也有分布[16]

      产甲烷菌的代谢途径是以乙酸、CO2和一些简单的甲基化合物作为底物生产CH4的过程。根据其利用底物的不同,可以将产甲烷菌代谢途径分成三种类型:(1)乙酸型:通过裂解乙酸,将其羧基氧化为CO2,甲基还原为CH4,自然界中近70%生物产CH4来自于该途径,但仅methanosarcina[17]和methanosaeta[18-19]能够利用乙酸途径产CH4。(2)氢营养型:主要利用H2作为电子供体还原CO2生成CH4,绝大多数产甲烷菌均可以利用该途径[20]。(3)甲基营养型:该途径存在两种代谢模式,第一种为H2依赖型,以H2作为电子供体产CH4[21-22],仅有少数菌种使用这一方式;大多数采用的甲基营养型代谢途径是一种严格的甲基营养型,氧化甲基化合物自身产生的还原当量作为电子供体还原甲基化合物中的甲基基团[23]。三种代谢途径反应式见表 2

      表 2  不同代谢类型产甲烷菌的典型反应式

      Table 2.  Typical organisms of methanogenesis reactions

    • 根据甲烷氧化菌是否利用环境中的氧气作为电子受体,可以将其分为好氧甲烷氧化菌和厌氧甲烷氧化菌,如表 3所示[24]

      表 3  甲烷氧化菌的分类

      Table 3.  Taxonomy of methanotrophs

      好氧甲烷氧化菌的研究比较早,同时也较深入。Sohnge[25]在1906年分离得到了一株可以氧化甲烷的菌株,Whittenbury等[26]在1970年分离鉴定了100多种以CH4作为底物的细菌,为好氧甲烷氧化菌的发展奠定了坚实的基础。Bowman[27-30]在1993年对好氧甲烷氧化菌进行了更加清晰的描述与分类。迄今为止,已经发现了多种不同的好氧甲烷氧化菌。他们分属于变形菌门(proteobacteria)、疣微菌门(verrucomicrobia),疣微菌门的甲烷氧化菌迄今只分离到了3个菌株,都是从极端环境中得到的,包括火山附近的沼泽土壤及酸性温泉,其最适生长温度约为55 ℃。

      多年以来,科学界仅发现了在有氧条件下进行的甲烷氧化作用。直到1976年,Reeburgh[31]首次证实了甲烷厌氧氧化(anaerobic oxidation of methane,AOM)的存在,他发现在海洋含氧层中CH4没有消耗,在缺氧层中却被快速消耗,因此只可能是厌氧氧化过程的存在导致了CH4减少。1999年,Hinrichs等[32-34]先后通过FISH试验以及14C标记的CH4同位素示踪分析发现,AOM过程主要通过以硫酸盐为受体的产甲烷古菌完成。2004年,Islas-Lima等[35]首次证明了反硝化型AOM过程的存在。2006年,Raghoebarsing等[36]成功富集反硝化型AOM过程的功能微生物,并定义的新亚门——NC10门细菌。相比于海洋,湿地中的AOM过程发现较晚,Smemo和Yavitt[37]直到2007年才首次证明了AOM过程在湿地中存在。以Mn4+和Fe3+作为电子受体的AOM研究开展相对滞后。2009年,Beal等[38]首次发现了以Mn4+和Fe3+作为电子受体的甲烷厌氧氧化过程的存在,但是其机理仍未证实。

    • 甲烷氧化菌分布广泛,在河流、湖泊、稻田、泥土、湿地、森林和海洋等生态系统中均都检测到了它们的存在。在CH4浓度较低的环境如森林、草原等,甲烷氧化菌每年氧化约3千万吨CH4;而在CH4浓度较高的环境如湿地、水稻土等,其中的甲烷氧化菌每年氧化CH4的量约占该环境中CH4总产量的一半。根据需氧与否,可将甲烷氧化菌分为好氧甲烷氧化菌及厌氧甲烷氧化菌两种类型。好氧甲烷氧化菌可以根据细胞的内膜结构、磷脂脂肪酸成分和碳同化途径分成三类,见表 3,第一类为Ⅰ型菌和X型菌,它们分属γ-变形细菌和α变形细菌,都利用5-磷酸核酮糖同化途径(RuMP)同化甲醛[39],但不同之处在于X型含有低水平的丝氨酸途径酶,且生长温度比Ⅰ型高[40]。第二类中,Ⅱ型菌同化甲醛的途径是丝氨酸途径(serine pathway)。第三类好氧甲烷氧化菌主要由极端噬甲酸菌组成,先将CH4转化成CO2,再利用卡尔文循环同化CO2[41]

      好氧甲烷氧化菌是在一些主要酶的作用下进行代谢作用的,首先好氧甲烷氧化菌在甲烷单加氧酶(MMO)的作用下将CH4氧化成甲醇,再利用甲醇脱氢酶(MDH)将甲醇进一步氧化生成甲醛,一部分甲醛进入丝氨酸循环(serine pathway)或戊糖磷酸途径(RUMP Pathway);另一部分甲醛在甲醛脱氢酶(FADH)作用下生成甲酸,甲酸被甲酸脱氢酶(FDH)彻底氧化生成CO2和H2O,并伴随生成大量还原性辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)[42]

      由于厌氧甲烷氧化菌不易培养,因此,关于厌氧甲烷氧化菌的研究进展比较缓慢。目前根据电子受体的不同将AOM分为三类,硫酸盐还原型甲烷厌氧氧化(sulphate-dependent anaerobic methane oxidation,S-DAMO)、硝酸盐或亚硝酸盐还原型甲烷厌氧氧化(denitrification dependent anaerobic methane oxidation,D-DAMO)以及Mn4+和Fe3+还原型甲烷厌氧氧化(metal ion dependent anaerobic methane oxidation,M-DAMO)。

      (1) S-DAMO由厌氧甲烷氧化古菌(anaerobic methanotrophic archaea)和硫酸盐还原细菌(sulfate-reducing bacteria,SRB)通过共生关系完成反应[43]

      (2) D-DAMO主要由厌氧甲烷氧化古菌(ANME-2d)[44]和NC10门细菌(以M.oxyfera为代表)[45]共同完成反应。

      (3) 参加M-DAMO反应的主要是未培养细菌Marine Benthic GroupD (MBGD),同时古菌ANME-1、ANME-2、ANME-3也参加了此反应[38],见表 3

      目前,针对厌氧甲烷氧化古菌的代谢途径还不是很清楚,现阶段,提出可能的S-DAMO途径有3种:

      (1) 逆甲烷生成途径:逆甲烷生成途径是最早被提出关于AOM途径的假说, 也是目前研究最多的。该假说认为S-DAMO与产甲烷过程密切相关,两者反应方向相反,中间产物一致。S-DAMO以甲烷作为起始反应物,最终氧化产物为CO2,具体反应路径如下:

      (2) 乙酰生成途径:根据参与反应的底物,可将该途径分成两种类型[46]:第一种是CH4被甲烷氧化菌氧化生成H2和乙酸,生成的产物进一步被硫酸盐还原菌利用产生HCO3-和HS-;第二种是甲烷氧化菌在CO2参与下将CH4氧化为乙酸,产生的乙酸为硫酸盐还原菌提供碳源,将还原为HS-。具体途径如下

      途径一:

      途径二:

      (3) 甲基生成途径:CH4和HS-被甲烷氧化菌利用生成甲硫醚(CH3SH),产物进一步被脱硫菌利用,生成HCO3-和HS-[47],具体反应如下所示:

      负责D-DAMO过程的NC10门细菌具有较特殊的代谢途径,目前普遍比较认同的一种代谢途径为NC10门细菌利用一种内部好氧反硝化(intra-aerobic denitrification)途径进行CH4的氧化,在该途径中,NO2-被分解为NO和O2,从而用于CH4的活化及氧化,或被终端呼吸氧化酶(terminal respiratory oxidases)用于呼吸作用[48-49]

      目前为止,由于缺乏足够的M-DAMO富集培养物,有关M-DAMO的研究还处于起步阶段,其代谢机理研究尚不清楚。

    • 产甲烷菌与甲烷氧化菌生态研究的传统方法是细菌分离培养,但却由于培养要求较高、生长缓慢而倍受局限,且然环境中微生物群落极其复杂,依赖于传统的培养方法已无法对甲烷代谢菌的多样性进行充分研究[50]。近年来,通过提取微生物基因组DNA直接对微生物进行研究的分子生物学技术,克服了传统方法中绝大多数微生物难以分离培养的缺点,能够提供丰富的不可培养的微生物信息,逐渐发展成为研究环境中微生物的群落结构、多样性、丰度及功能的有效手段。

      目前,针对自然湿地土壤产甲烷菌和甲烷氧化菌的研究常采用的现代分子生物学技术主要包括基因克隆文库技术(cloning library technology)、末端限制性酶切片段长度多态性(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)、变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)、荧光原位杂交技术(fluorescent in situ hybridazation,FISH)、扩增子高通量测序技术(high-throughput sequencing)、宏基因组技术(metagenome technology)和实时定量PCR技术(quantitative real-time PCR, qPCR)等。

      在产甲烷菌群落结构、多样性及丰度分析的研究中,16Sr RNA基因和mcrA功能基因被广泛应用作为产甲烷菌检测的标记基因。陈颖等[51]采用克隆文库及qPCR技术,对桂林会仙岩溶湿地15~35 cm沉积物中mcrA基因进行了研究,推测会仙岩溶湿地具有同普通淡水湿地类似的产甲烷菌群落组成和较高产CH4潜力,并推测该环境中可能蕴藏着许多尚未被发现的微生物资源。Dettling等[52]以16Sr RNA为标记基因,利用RFLP技术从美国芝加哥酸性苔藓泥炭沼泽检测到四种产甲烷菌群,并发现酸碱性对产甲烷菌的群落多样性有较大的影响。

      在甲烷氧化菌群落结构分析的研究中,16Sr RNA基因和pmoA功能基因被广泛应用。pmoA基因几乎存在于所有的甲烷氧化菌,编码pMMO关键酶的一个亚基,故pmoA被广泛地用于甲烷氧化菌的生物标记物。国外针对湿地中甲烷氧化菌的研究始于较早,主要集中在其代谢研究及与环境因子的关系等方面。Danilova等[53]基于16Sr RNA和pmoA基因对俄罗斯靠近北极圈地区的湿地土壤中甲烷氧化菌进行多样性和遗传进化分析,结果发现实验获取的大约80%的泥炭沼泽甲烷氧化菌pmoA基因片段属于甲基孢囊菌属中的一种微需氧螺旋型甲烷氧化菌。近年来,我国已逐步开展了自然湿地中甲烷氧化菌的研究,周玉[54]对内蒙古高原某干涸的湖泊湿地甲烷氧化菌的功能基因pmoA进行了RFLP分析,甲烷氧化菌在湖心区、湖底区的多样性指数和均匀度指数相对较高,而在较早干涸的湖坡区以及相邻草原的对照区其相关指数较低。Yun等[55]通过高通量测序技术以及qPCR技术对三江湿地中不同类型沼泽土壤中甲烷氧化菌群落结构及丰度进行了研究,不同类型的湿地土壤中的甲烷氧化菌的群落结构及丰度具有显著差异。Zelek等[56]基于mcrA基因、pmoA基因以及16Sr RNA基因,采用高通量测序技术时定量PCR分析等方法, 对崇明岛东滩潮间带滩涂(无植被生长)和盐沼地(有植物生长)沉积物中产甲烷菌和甲烷氧化菌群落进行了分析。揭示了该地区产甲烷菌和甲烷氧化菌群落结构及丰富度特性。还证实了互花米草入侵该河口湿地对甲烷循环相关微生物产生明显影响。研究技术手段的快速发展,为环境中产甲烷菌以及甲烷氧化菌在湿地生态系统调节及生态价值评估等方面提供了较大的便利,大大减少了实验的成本与时间。

    • 温度影响着湿地中产甲烷菌的代谢速率、底物量和群落结构。大多数产甲烷菌的最适温度为35 ℃~40 ℃[57],在低温环境下,产甲烷菌活性降低,从而导致CH4产生量降低;微生物介导的有机物分解能力减弱,从而导致产甲烷菌可直接利用的底物减少;温度还可使湿地中产甲烷优势菌的种类发生演替,造成产甲烷途径的改变,从而影响湿地中甲烷产生能力[58]。甲烷氧化的最适温度为25 ℃~35 ℃,但温度对甲烷氧化菌的影响较小,即便在极端条件下湿地中土壤也具有氧化CH4的能力。

    • 产甲烷菌对环境中pH的变化较为敏感,生长适宜的pH范围为6~8。甲烷氧化菌对环境的酸性耐受程度比产甲烷菌高,其最适pH范围为5.5~6.5[59]。但pH变化对CH4产生率的影响不是绝对的,这也与湿地类型有较大的联系,Wang等[60]发现,酸性土壤施加尿素会导致pH升高,进而促进CH4的产生,但在非酸性土壤中加入尿素则会抑制CH4的产生。

    • 土壤中氧化还原电位(Eh)决定着微生物和及各种酶的活性,是影响湿地中产甲烷菌和甲烷氧化菌的重要因子。产甲烷作用位于呼吸链的最末端,通常要求Eh较低,一般情况下,CH4产量随土壤Eh的降低而增加,临界土壤的Eh起始值大约为-140 mV,当土壤的Eh从-200 mV降低至-300 mV时,CH4的产量约增加10倍,而其排放量约增加17倍[61]。一般认为,产甲烷菌的最适氧化还原电位在-320 mV以下,相当于绝对的无氧环境,但在氧化还原电位-160 mV条件下产甲烷菌也可缓慢生长。

    • 有机质是产甲烷菌底物来源,且湿地中的产甲烷作用与有机质含量具有正相关性,且高的有机质含量也会促进甲烷氧化作用。Bergman和Klarqvist[62]等人发现,CH4的产生速率主要受湿地中溶解有机碳的影响,其浓度对产甲烷菌的活性影响非常明显,有机碳越多,CH4的排放量就越大。Singh等[63]也发现了相似结论,即CH4排放量随沉积物中有机碳含量升高而增大。

    • 湿地水位主要决定土壤的厌氧程度。一般情况下,水位越高,其厌氧程度越大,产甲烷菌的活性就越高[64],但水位对甲烷氧化菌的影响则是不同的。Kettunen等[65]研究指出CH4产生量在地表水位20 cm以下出现最大值,而CH4氧化能力是在水位10 cm以下出现的最大值。Sun等[66]发现,当水位在地表下20~30 cm时,湿地氧化CH4的能力大于产生能力。

    • 植物是湿地中重要组成部分,根际会产生分泌物和脱落物,为产甲烷菌提供丰富有机物质,影响其活性[67]。湿地植物的通气组织可作为氧气传输通道,将氧气传输到植物根部从而促进甲烷氧化作用。

    • 湿地是大气中CH4的重要自然源,了解湿地产甲烷菌以及甲烷氧化菌代谢机制、及影响因素,对于调控湿地CH4循环及减缓温室效应具有重要的意义。CH4代谢及排放是一个复杂而综合的过程,涉及到土壤温度、pH及氧化还原电位等多种环境因素,并在各种因素共同作用下实现的。产甲烷菌纯培养物的获取及不同类型湿地中的多样性差异具有一定的研究意义,另外,产甲烷菌生存适应能力较强,在环境适应性研究方面也有一定的发展潜力。针对甲烷氧化菌的研究目前更多是集中于酸性泥沼湿地或泥炭藓湿地,今后的研究中,应借助分子生物学技术以及高通量测序技术的进步,对其进行更深的研究和开发,以便对湿地甲烷的产生与氧化、CH4排放通量调控提供参考。

      相信随着分子生物学技术和高通量测序技术的不断发展,更多在湿地中存在的产甲烷菌和甲烷氧化菌会不断被发现,在全球范围内各生态环境中的研究成果也将会被不断累积,人们对湿地产甲烷菌及甲烷氧化菌生理特点和生态特征将变得逐渐清晰和完备。

参考文献 (67)

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