Description of nitrogen metabolism pathway based on Skeletonema marinoi transcriptome
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摘要:
本研究分别选取了不同生长时期、不同温度培养以及低硅条件培养的玛氏骨条藻（Skeletonema marinoi），以Illumina Hiseq 2000平台进行转录组高通量测序分析，共获得39,098个转录本。通过NR注释、GO注释和KEGG通路注释等一系列生物信息学手段对该转录组进行了基因注释和代谢途径分析。在此基础上重点分析了玛氏骨条藻的氮代谢途径，发现共存在20种酶和蛋白及6条相关代谢途径。对38个编码这些酶的基因序列比对结果表明，其与假微型海链藻同源基因具有较高的一致性。同时对这些样品进行数字基因表达谱分析，获得不同生长时期氮代谢途径中酶和蛋白的编码基因的差异表达情况：与对数期相比，在稳定期参与硝酸盐同化过程的两种酶（硝酸盐还原酶、亚硝酸还原酶）的基因和参与氨氮代谢的两种酶（氨甲酰磷酸合成酶和氨基甲酸激酶）的基因均有明显的上调表达，这是玛氏骨条藻对所处的不同生长状态下氮元素存在形态的变化所做出的分子响应。由转录组测序构建的代谢途径及相关基因的差异表达信息有助于对玛氏骨条藻氮代谢关键酶基因调控过程的解析，为进一步研究赤潮藻氮素营养限制过程中相关基因的表达调控模式奠定了基础，可为深入了解赤潮藻对营养元素的利用提供依据。
Abstract:The transcriptomeof Skeletonema marinoi at different growth stages,different temperatures and low silicon concentration was analyzed with Illumina Hiseq 2000 platform sequencing technology,producing and identifying 39,098 transcripts totally.Assembled sequences were subjected to NR BLAST similarity searches and annotated with Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes orthology (KO) identifiers.These analyses identified the important metabolic pathways and genes of S.marinoi,especially the nitrogen metabolism pathway involving 20 enzymes and proteins.Comparative analysis of enzyme-coding genes among S.marinoi,Thalassiosira pseudonana and Phaeodactylum tricornutum using BLASTx revealed relatively high homologous genes between S.marinoi and T.pseudonana.Using the Digital Gene Expression Profiling,we also found different gene expression in the pathway.Compared to exponential growth phase (EP),three genes coding nitrate reductase or nitrite reductase which were involved in nitrate assimilation process showed significantly increasing expression in stationary phase (SP),as well as carbamoyl-phosphate synthase-coding and carbamate kinase-coding genes.The results indicated the molecular responses of S.marinoi on the nitrogen changes in different growth phases.Our study will contribute to analyze gene regulation of key enzymes involved in nitrogen metabolism of S.marinoi,providing a basis to enhance our knowledge about gene expression and regulation patterns in nitrogen limitation,which will be beneficial to in-depth understand the nutrients utilization in harmful algae bloom species.
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Keywords:
- Skeletonema marinoi /
- nitrogen metabolism /
- RNA-seq
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氮代谢是植物的基本生理过程之一，也是生物地球化学循环的重要组成部分。植物氮素同化的主要途径是硝酸盐经过硝酸盐还原酶、亚硝酸还原酶等一系列酶的催化作用转化为氨以供植物细胞利用，参与氨基酸的合成与转化，再以氨基酸为主要底物在细胞中合成蛋白质，经过对蛋白质的修饰、分类、转运及储存等成为植物有机体的组成部分，该过程与植物的碳代谢等协调统一，共同成为植物生命活动的基本过程[1]。氮素作为浮游植物生长的一个重要限制因子[2]，亦是海洋植物生长发育不可缺少的营养元素。有研究表明，目前世界上多数海区都处于氮限制状态[3]。近年来随着海洋生物地球化学研究的不断深入，不同浮游植物营养盐代谢的生化和分子基础引起了人们的重视[4-7]，通过研究氮代谢来了解海洋微藻对氮素营养利用情况成为研究赤潮形成机制生物因素的重要方面。另一方面由于氮利用对藻体本身含氮物质的积累的影响及脂肪酸积累的效应，人们也积极关注产油微藻的氮代谢与脂类物质积累的关系。一些研究结果表明，不同氮源种类、氮源浓度都会影响油脂的积累和脂肪酸组分的变化和藻体生长[8-11]。因此，对氮代谢的研究无疑也会对产油微藻油脂含量的提高提供了重要的理论基础以及新的思路和方法。
随着分子生物学技术的飞速发展，自上世纪80年代后期开始，一些研究已开始从分子水平揭示硅藻生理代谢、分化发育和系统发生过程。进入21世纪以来，随着高通量测序技术的迅猛发展，转录组测序技术已在植物生理学研究中广泛应用，特别是通过对miRNA的高通量测序来研究一些经济作物对抗极端环境的生理响应的分子机制有着非常重要的科学和现实意义[12-13]。转录组测序技术运用到藻类研究中，亦给我们带来前所未有关于藻类进化、生理生化及生态等方面的相关知识。转录组测序技术通过对海洋微藻的转录组进行高通量测序，能在没有基因组信息的情况下对基因组进行转录水平的分析，从而确定编码代谢途径相关酶的基因。在此基础上解析相关的生物合成途径，并对差异表达的基因和蛋白质进行定量和分析，有助于了解参与生物生长代谢过程的代谢组件及其可能的参与方式及其与环境互作的代谢方式[14-18]。从生态学的角度，从分子水平阐明各代谢途径有助于深入理解和阐述藻类引发赤潮的发生、发展、消亡的内在分子机理，从而为赤潮的有效防治提供理论基础。从应用角度，解析生物合成与代谢过程中的反应及基因调控亦会帮助人类更好地控制和利用微藻所产生的结构独特的次生代谢产物。
骨条藻(Skeletonema spp.)是一类在全球近岸海域广泛分布的广温广盐型海洋微型浮游硅藻，其中一些种类常在世界各地海域形成赤潮，会使得养殖的海洋经济动物受到伤害乃至窒息性死亡，对海洋生态环境造成严重危害，因此引起了赤潮研究者的广泛关注[19]。玛氏骨条藻(S.marinoi)是2005年由Sarno等分离确认的，是骨条藻属5种今生种之一[20]，也是中国近海海域常见种。本研究中我们测定并分析了玛氏骨条藻在不同生长时期的转录组，确定了其氮代谢途径相关酶基因，并在此基础上分析玛氏骨条藻氮代谢途径，以期为阐明氮素营养影响该藻生长发育的内在机制提供分子依据。
1 材料与方法
1.1 玛氏骨条藻的培养
玛氏骨条藻(S.marinoi)分离自青岛近海，保存于中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室藻种室，该藻种在实验室中用常规f/2培养液培养，光照/黑暗周期为12 h/12 h，光照强度为80~100 μmol photon /m2 /s，培养温度为20±1℃。实验用海水取自青岛近海，盐度为33，pH为7.8~8.0。
1.2 测序样品准备
分别按以下3种方式培养和收集藻细胞：①生长时期组：在藻种接种后的指数期(exponential phase，EP)、稳定期(stationary phase，SP)和衰亡期(decline phase，DP)分别取样；②高低温组：分别设定高温(30℃)和低温(12℃)培养条件，收集处于指数生长期的藻细胞；③低硅生长组：将培养基中Na2SiO3的浓度设为2 μM，其他同f/2，收集处于指数生长期的藻细胞。每个样品做3个平行样，离心收集藻细胞，立即放入液氮中保存样品，样品由北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行总RNA的提取及Illumina Hiseq 2000双端测序。
1.3 数据预处理及de novo拼接
为了保证信息分析质量，需对Illumina Hiseq 2000双端测序得到的原始序列(Raw Reads)进行预处理：去掉里面含有接头的、低质量的测序片段得到有效序列(Clean Reads)。用拼接软件Trinity(r2012-10-05)[21]将有效序列进行de novo拼接，形成一个转录组，以此作为后续分析的参考序列(ref)。
1.4 功能注释及代谢途径分析
将拼接得到的转录组利用NCBI blast 2.2.28+[22] 算法分别比对到NCBI的NR、NT、Swiss-Prot和KOG数据库中，其中KOG的Evalue阈值设为1e-3，其他3个Evalue阈值设为1e-5，从而预测转录本的功能并进行功能分类。利用HMMER 3.0 package进行Pfam蛋白结构预测。利用软件Blast2GO v2.5[23]和自写脚本进行GO功能注释得到基于NR和Pfam两部分的蛋白注释结果。拼接得到的转录组提交到KAAS服务器进行KEGG代谢途径分析[24-25]。最后利用RSEM软件[26]将每个样品的有效序列往参比序列上做定位分析。RSEM中使用bowtie默认参数。对bowtie的比对结果进行统计，进一步得到每个样品比对到每个基因上的read count数目。通过DESeq对read count数据做标准化处理后进行基因差异表达分析[27-29]，利用该值对不同生长时期下相关代谢途径中基因的表达水平进行比较。
2 结果与讨论
2.1 转录组测序信息及拼接
对Illumina Hiseq 2000双端测序获得的原始数据进行过滤去除低质量数据后共获得58,592,306 的用于拼接的高质量有效序列，占原始序列的96.15%，将所有的有效序列利用de novo拼接总共获得39,098个转录本，20,319个unigene，长度范围为200~20,000 bp(表 1)。
表 1 拼接长度频数分布Tab. 1 Summary for splice length frequency distribution
2.2 功能注释及代谢途径分析
拼接得到的所有转录本比对到各数据库结果显示，10,826个的转录本能够注释到GO编号，同时5,095个转录本能够与KOG数据中的序列比对上。根据GO注释结果将转录本分成46个分类，分别属于生物过程、细胞组分和分子功能三大类。同样，根据KOG数据库的比对结果，将比对上的转录本按照功能分成26个子家族。通过KEGG代谢途径分析拼接得到的所有转录本，3,816个转录本可以比对分配到EC编号，并注释到225条不同的代谢途径，包括氮代谢途径，以及谷氨酸代谢，精氨酸、脯氨酸代谢等6个间接参与了氮代谢的途径(图 1)。
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图 1 基于S.marinoi转录组数据的de novo拼接及注释结果构建的氮代谢途径酶/蛋白由长方框出，代谢通路由椭圆框出Fig. 1 Nitrogen metabolism pathway reconstructed based on the de novo assembly and annotation of S.marinoi transcriptomeEnzymes or protein are shown in solid boxes and metabolism pathways are shown in cycles2.3 氮代谢途径分析
基于转录组的功能注释及代谢途径分析，我们发现了玛氏骨条藻氮代谢途径中20个相关酶以及38个编码基因的转录本，每个酶有1~4个转录本(表 2)。我们利用BLASTx进一步比较分析了玛氏骨条藻氮代谢编码酶基因序列与硅藻假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)和三角褐脂藻(Phaeodactylum tricornutum)的同源基因的一致性，结果显示：玛氏骨条藻与同属中 心纲的假微型海链藻有着相对更高的基因序列一致性，而与羽纹纲的三角褐脂藻的序列一致性相对较低(表 2)。
表 2 玛氏骨条藻转录组注释到的存在于氮代谢途径的酶及转运蛋白的转录本Tab. 2 Enzymes and transporters transcripts which is associated with nitrogen metabolism annotated in the S．marinoi trancsriptome
结合KEGG的比对结果分析我们构建了玛氏骨条藻氮代谢途径(图 1)。其氮代谢始于从环境中摄取的无机营养，通过特异的硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白(NRT)系统将硝酸盐/亚硝酸盐转运入细胞内供进一步同化利用。
硝酸盐同化是植物体将外界吸收来的硝态氮营养元素转化为氨态氮进一步形成有机物和贮存能量的过程。硝酸盐还原酶作为氮利用的起始酶，广泛存在于光合自养生物的体内，同时也是硝酸盐同化过程的关键性限速酶和调节酶。它将浮游植物所吸收的氧化态氮化合物转化为还原态氮，进一步完成氮在体内的循环代谢[]，同时它与藻类的其它生物代谢和光合作用、以及各种细胞的信号转导过程密切相关[32]。我们在玛氏骨条藻转录组中发现了硝酸盐同化途径酶的编码基因转录本(图 1，表 2)，此过程首先由硝酸盐还原酶(NR，EC：1.7.99.4)催化硝酸盐生成亚硝酸盐的还原反应。由于亚硝酸盐对细胞有毒性，随后的亚硝酸还原酶(NIRA，EC：1.7.7.1; NIRB，EC：1.7.1.5)催化亚硝酸盐生成氨，它们分别以铁氧还蛋白和NADH为辅酶。
我们在玛氏骨条藻转录组中同样发现催化氨的代谢过程的酶的编码基因转录本(图 1，表 2)。其中，谷氨酸脱氢酶(GDHA，EC：1.4.1.4)、谷氨酰胺合成酶(GLNA，EC：6.3.1.2)和谷氨酸合成酶(GLT1/B/D，EC：1.4.1.13/14/1.4.7.1)能够利用氨催化生成L-谷氨酸和L-谷氨酰胺参与谷氨酸代谢。此外，氨甲酰磷酸合成酶(CPS，EC：6.3.4.16)是氨向生物体有机态转变的重要酶，催化氨与CO2的耗ATP过程生成氨甲酰磷酸。氨甲酰磷酸在氨甲酰转移酶(OTC，EC：2.1.3.3)催化下，将氨甲酰基转移给尿素循环的鸟氨酸生成瓜氨酸，随后瓜氨酸的胍基在精氨琥珀酸合成酶(ARGG，EC：6.3.4.5)催化作用下，与天冬氨酸的氨基缩合形成精氨琥珀酸。精氨琥珀酸经精氨琥珀酸裂解酶(ASL，EC：4.3.2.1)催化生成精氨酸。最终，精氨酸酶(ROCF，EC：3.5.3.1)将精氨酸水解产生尿素及再生成鸟氨酸，完成一个尿素循环。此外，精氨酸和瓜氨酸在一氧化氮合成酶(NOS1，EC：1.14.13.39)催化下可以互变，以补充特定时期对不同氨基酸的需要。
尿素循环对植物代谢有重要的意义，其各中间产物具有重要作用：鸟氨酸、精氨酸参与精氨酸和瓜氨酸的生物合成和代谢过程；精氨琥珀酸酶催化产生的延胡索酸使尿素循环与柠檬酸循环联系起来。另外，由于脲酶的存在，植物的内、外环境中的尿素对于植物吸收外部氮源供其生长发育以及维持植物体内的氮代谢平衡和再利用等具有重要的生理意义[33]。在特定的环境条件下，尿素的产生也会进入藻体被循环利用，以增强藻类对低氮环境的耐受性。如尿素循环能够促进抑食金球藻(Aureococcus anophagefferens)对尿素的吸收以耐受氮限制，这在一定程度上解释了有机氮源引发的抑食金球藻褐潮暴发的原因[34]。我们发现玛氏骨条藻亦存在脲酶(URE，EC：3.5.1.5)将尿素分解产生氨。
另外，玛氏骨条藻氮代谢中还存在一些对氨的内源补充途径，如氰基氨基酸代谢产物甲酰胺可以在尿氨酸甲酰胺酶(FM，EC：3.5.1.49)催化下生成氨，另一产物甲酸盐通过甲烷代谢和乙醛酸代谢与碳代谢相联系。氨基甲酸激酶(ARCC，EC：2.7.2.2)、氰酸裂解酶(CYNS，EC：4.2.1.104)和碳酸酐酶(CA，EC：4.2.1.1)也能够催化氨甲酰磷酸生成氨的反应，以补充氨的消耗，同时生成ATP。
2.4 氮代谢途径中基因差异表达的分析
我们比较了分别处于指数期(exponential phase，EP)、稳定期(stationary phase，SP)和衰亡期(decline phase，DP)3个生长时期的玛氏骨条藻的氮代谢途径中编码相关酶基因的表达水平。发现与氮代谢相关的20个酶的编码基因表达量在3个生长时期有2倍以上差别的基因有9个。图 2中列出了这些差异表达基因在不同生长时期基因表达量，具体的基因编号如表 2“**”部分注出。如图 2-A、B、C所示，在玛氏骨条藻氮代谢途径中，参与硝酸盐同化过程的硝酸盐还原酶(NR，EC：1.7.99.4)在稳定期的基因表达量是指数期的6.20倍，亚硝酸盐还原酶(NIRA，EC：1.7.7.1; NIRB，EC：1.7.1.15)的两个基因在稳定期的表达量都明显高于指数期，差异表达倍数分别是2.27和2.68，表明在玛氏骨条藻生长进入稳定期后，需要合成更多的硝酸盐同化途径的酶，以将更多的硝态氮转化为氨态氮供生物利用。硝态氮是海水中的一种最主要的氮存在形态，硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶基因表达变化体现了其对外部环境氮的吸收和同化的生理和分子响应。通过监测这些指标，将有助于我们了解赤潮发生的分子机理。
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图 2 氮代谢途径中差异表达的基因基因表达量有2倍以上差异视为显著。各柱状图横坐标表示不同生长时期：EP，指数期；SP，稳定期；DP，衰亡期，纵坐标为用经DESeq标准化处理过的read count表征基因表达量，用log2 (standardized read count)表示Fig. 2 Different gene expression involving in nitrogen metabolism*： More than 2 fold reached to the significant gene expression differences.In each bar chart，the horizontal ordinate represents different growth stages：EP，exponential phase; SP，stationary phase; DP，decline phase.The vertical ordinate represents gene expression which was calculated by log2 (standardized read count)如图 2-D所示，在氨氮代谢中，氨甲酰磷酸合成酶(CPS，EC：6.3.4.16)在稳定期的表达量明显高于指数期和衰亡期，差异表达倍数分别为3.76和3.54，表明在指数期氨甲酰磷酸合成酶的低含量使玛氏骨条藻大量积累氨，在稳定期需要更多的氨甲酰磷酸合成酶将氨带入氨基酸的生物合成途径；而在衰亡期，氨基酸的降解代谢产生大量的氨，将刺激更多的氨甲酰磷酸合成酶的合成。由图 2-E可知，与氨甲酰磷酸相关的另一个酶，氨基甲酸激酶(ARCC，EC：2.7.2.2)在稳定期的基因表达差异倍数明显高于指数期，也说明由于稳定期的氨基酸生物合成速度减慢而积累了大量的氨甲酰磷酸需被还原成氨，排除体外或重新进入循环。
参与谷氨酸代谢的两种酶基因表达量有明显的变化。如图 2-F所示，谷氨酸脱氢酶(GDHA，EC：1.4.1.4)基因在稳定期表达量明显高于衰亡期，表明在稳定期谷氨酸代谢更旺盛。另外参与谷氨酸合成的谷氨酸合成酶(GLT1，EC：1.4.1.13)和(GLTB，EC：1.4.1.14)在对数期基因的表达量明显高于稳定期和衰亡期(图 2-G、H)，表明处于指数期的玛氏骨条藻的谷氨酸合成更旺盛，以满足蛋白质的生物合成。但与此相反，催化谷氨酸合成的另一种谷氨酸合成酶(GLTD，EC:1.4.7.1)基因相对表达量在指数期却明显低于稳定期(图 2-I)，这可能与此基因编码的酶所依赖的辅酶(铁氧还蛋白)不同于以上两种(NAD(P)H)有关(表 2)，即不同生长周期藻体内的辅酶种类不尽相同对基因表达产生的影响。相比以上的变化，参与硝酸盐转运的蛋白和尿素循环的酶的编码基因在不同生长时期没有发现显著的表达差异。
氨甲酰磷酸合成酶、氨基甲酸激酶、谷氨酸脱氢酶等基因表达的变化体现了藻体在应对内环境中氮素变化做出的分子响应。通过监测这些分子因素，将助益我们了解赤潮发展、消亡的分子机理。众所周知，无机氮素含量的增高是赤潮发生的营养盐条件[35]，因此我们通过监测氮代谢中关键酶的基因表达变化，能够剖析赤潮发生和发展的分子机理，从而对赤潮起到一定的预警和干预作用。
3 结论
本研究通过对玛氏骨条藻进行转录组测序和分析，发现玛氏骨条藻中存在20个与氮代谢相关的酶以及38个编码这些酶的基因。序列比对结果表明，这些编码基因与硅藻假微型海链藻有较高的序列一致性。基于KEGG注释结果，分析了玛氏骨条藻的氮代谢途径。通过比较玛氏骨条藻不同生长时期的转录组，发现其氮代谢途径中一些编码关键酶的基因差异表达情况。相比于对数期，在稳定期参与硝酸盐同化过程的两种酶(硝酸盐还原酶，亚硝酸还原酶)的3个基因参与氨氮代谢的氨甲酰磷酸合成酶和氨基甲酸激酶等的基因表现出明显的上调表达，这是玛氏骨条藻对所处的不同生长状态下氮元素存在形态的变化所做出的分子响应。这些结果为进一步研究赤潮藻氮素营养限制过程中相关基因的表达调控模式奠定了基础，也为深入了解氮的生物地球化学循环过程增添了新的认识。
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图 1 基于S.marinoi转录组数据的de novo拼接及注释结果构建的氮代谢途径
酶/蛋白由长方框出，代谢通路由椭圆框出
Fig. 1. Nitrogen metabolism pathway reconstructed based on the de novo assembly and annotation of S.marinoi transcriptome
Enzymes or protein are shown in solid boxes and metabolism pathways are shown in cycles
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图 2 氮代谢途径中差异表达的基因
基因表达量有2倍以上差异视为显著。各柱状图横坐标表示不同生长时期：EP，指数期；SP，稳定期；DP，衰亡期，纵坐标为用经DESeq标准化处理过的read count表征基因表达量，用log2 (standardized read count)表示
Fig. 2. Different gene expression involving in nitrogen metabolism
*： More than 2 fold reached to the significant gene expression differences.In each bar chart，the horizontal ordinate represents different growth stages：EP，exponential phase; SP，stationary phase; DP，decline phase.The vertical ordinate represents gene expression which was calculated by log2 (standardized read count)
表 2 玛氏骨条藻转录组注释到的存在于氮代谢途径的酶及转运蛋白的转录本
Tab. 2 Enzymes and transporters transcripts which is associated with nitrogen metabolism annotated in the S．marinoi trancsriptome
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