细菌广泛存在于海洋环境及动物消化道和体表，是海洋微食物环物质和能量的核心^[1]，也是宿主肠道功能发挥的重要参与者。肠道是营养物质吸收的重要场所，其中寄居的微生物数量庞大、结构复杂，与宿主相互依赖、相互制约，并形成独特的肠道微生态系统，在宿主的营养消化、生长发育、抵御病害等过程中发挥重要作用，被视为“额外器官”^[2-3]。微生物在肠道中的积累受自身及外界诸多因素(如生境、季节、宿主食性、饵料等)的影响^[4-5]，不同菌群之间存在对生存空间、营养及能量的竞争，一个稳定的微生物菌群对养殖动物的健康极其重要^[6]。养殖环境中大部分异养菌依然作为分解者存在，但部分细菌的大量繁殖可威胁到养殖动物的健康，从而引发疾病^[7]。弧菌是自然界中适应能力最强的细菌类群，也是引起海水养殖动物病害最常见且最严重的细菌性病原之一^[8]，气候变化引起的理化因子改变是海洋弧菌病爆发的重要原因^[9]。已有研究表明环境中弧菌数量与温度、盐度等理化因子的变化密切相关^[10-12]，但有关水环境中理化因子对贝类肠道细菌数量积累的影响鲜有报道。

本研究选取中国东南沿海地区一种重要养殖贝类方斑东风螺(Babylonia areolate)为对象，该品种在近十年来由于集约化、高密度养殖及水处理不当等因素，在养殖过程中病害频繁发生，严重制约了整个产业的发展。秋冬季节为东风螺病害高发期，通过调查研究秋冬季方斑东风螺养殖水体总细菌、水体及底沙弧菌、东风螺消化道异养菌和弧菌数量及其与主要理化因子(水温、盐度、pH、溶解氧、氨氮、亚硝酸盐氮)、底沙营养盐(总氮、总磷)的相关关系，并应用主成分分析法分析各环境要素在秋冬季养殖期的时间分布特征，以期为方斑东风螺健康养殖、细菌性病害防控及商品螺质量安全方面提供参考。

1   材料与方法

1.1   采样点概况及监测周期

试验样品采自海南省万宁市山根镇某方斑东风螺室外工厂化养殖场，该养殖场采用水泥池离底铺沙流水式养殖模式，水由池上方纵向中轴线水管向两侧辐射进入养殖池，沙层底部滤水自净。每个养殖池水体积约4 m×6 m×0.5 m，底沙厚约3 cm。充气石布设密度约2 m²/个，24 h充气。养殖场采用统一管理，每日下午3~5点定时投喂适量冰鲜牡蛎肉，待东风螺摄食完毕后将残余饵料捞出养殖池，保持良好的养殖环境。本研究中所采集的东风螺样品于2015年8月27日出苗并进入养殖池工厂化养殖阶段，养殖密度约1000个/m²。试验选取3个养殖池为平行组，养殖场于2015年9月至2015年12月，每月7、17、27号左右上午9点开始采样检测东风螺消化道及养殖环境中微生物数量和环境的理化因子，持续监测4个月。

1.2   样品采集与处理

试验采用五点采样法分别采集养殖池表层以下约10 cm处的养殖水、螺生活层底沙和东风螺样品，并分别混匀备用。东风螺消化道异养菌、弧菌的监测现场完成；养殖水的监测项目包括水体温度、盐度、pH、溶解氧、氨氮、亚硝酸盐氮及水体总细菌、弧菌，其中用于测水体氨氮、亚硝酸盐氮、总细菌的样品均低温运回于实验室完成监测，其他项目均现场完成；养殖底沙监测项目包括总氮、总磷及弧菌数量，弧菌数量现场检测，用于总氮、总磷检测的底沙样品低温运回实验室完成。每次均对3个平行养殖池重复以上检测。

消化道异养菌及弧菌数量测定分别采用营养琼脂培养基、TCBS培养基(均购自广东环凯微生物科技有限公司，广州)培养法。现场采集5只大小一致、健康状况良好的东风螺，用无菌的解剖工具分别取消化道至无菌培养皿剪碎混匀，称取0.3~0.5 g至匀浆器用1 mL无菌生理盐水充分匀浆。取匀浆液梯度稀释至10^-1、10^-2、10^-3，各稀释梯度均取100 μL涂布上述两种平板，每个梯度做3个平行，将接种后的平板置于28℃恒温培养箱中培养48 h后，选取平均菌落数在30~300以内为有效，计数菌落形成单位(CFU)数。

水体弧菌数量测定采用TCBS培养法，现场取备好的样品分别用无菌海水做梯度稀释至10⁰、10^-1、10^-2，各稀释梯度均取100 μL进行涂布平板，每个梯度分别做3个平行，培养及计数方法同消化道细菌。水体总细菌计数采用DAPI荧光显微镜计数法，方法参考《海洋调查规范》(GB/T 12763.6-2007)。水体温度、盐度、pH、溶解氧均现场用水质测定仪(ProPlus, 美国YSI)测定，氨氮、亚硝酸盐氮质量浓度的测定参考《海洋监测规范》(GB 17378.4-2007)。

底沙弧菌数量测定采用TCBS培养法，现场取3个池的养殖底沙约1 g分别置于无菌的10 mL离心管中，并加入5 mL无菌海水充分震荡涡旋3 min，梯度稀释至10^-2、10^-3、10^-4 3个梯度，分别取3个梯度稀释液100 μL涂布平板，每个梯度分别做3个平行，培养及计数方法同消化道细菌。总氮、总磷质量浓度的测定均参考《海洋监测规范》(GB 17378.5-2007)。

1.3   数据统计分析

采用相关性分析法研究养殖系统内细菌数量与各理化因子的关系，并应用主成分分析法实现对养殖系统各项指标的降维处理，将具有相关性关系的一系列复杂指标转化为少数几个具有代表性的综合指标，综合分析各理化因子及微生物因子在时间上的分布。数据分析主要应用Excel 2016做初步的处理、相关性分析及主成分分析由SPSS 20.0完成，PCA图由Origin 9.1绘制，并由Adobe Illustrator CS5软件修改完成。

2   结果与讨论

2.1   方斑东风螺消化道及养殖水体、底沙细菌数量变化特征

方斑东风螺消化道及养殖水体、底沙中细菌数量变化如图 1所示。东风螺养成期水体总细菌、弧菌数量分别为4.8×10⁴~3.8×10⁵ cells/mL、2.1×10²~1.2×10⁴ CFU/mL(图 1a)，总细菌数量变化不大，弧菌在11月中下旬时出现最低值，可能与气温骤然下降有关，待弧菌适应变化后的水温后又渐渐回升，但仍低于9及10月份。弧菌是受温度调节较明显的类群，在适盐条件下，温度升高能加快弧菌的繁殖速度^{[9, 11]}。养殖底沙弧菌数量为6.0×10⁴~1.9×10⁶ CFU/g(图 1a)，始终较水体稳定，但在养殖1个月后有一定上升，可能是底质中营养盐含量升高引起。

图  1  方斑东风螺消化道及养殖水、底沙细菌数量变化

Fig.  1  Changes of bacterial density in the Alimentarytract of Babylonia areolate and its aquaculture Waterand Sediment

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消化道异养菌、弧菌数量分别为4.3×10⁴~5.9× 10⁶ CFU/g、2.0×10²~7.5×10⁵ CFU/g(图 1b)，二者的波动极显著正相关(P< 0.01)。消化道弧菌数量介于养殖水体与底沙之间，并低于军曹鱼^[7]消化道弧菌数量约3~5个数量级，与九孔鲍^[13]消化道弧菌数量接近；异养菌数量低于军曹鱼约2~3个数量级，低于九孔鲍约1~2个数量级。消化道异养菌在螺苗投入养殖池的第一个月，其数量逐渐上升，并在养殖约1个月后呈锯齿状下降并趋于稳定；弧菌数量在螺苗进入养殖池初期及10月上旬分别出现两个峰值，11月下旬出现最低值，可能是温度聚降引起。螺消化道异养菌及弧菌数量在刚进入养殖期的1~2个月内变化较大，这主要与个体免疫力及消化道发育水平有关^[14]。幼小个体的肠道微生物植入易受养殖环境中理化因子的影响，随着养殖时间的延长，螺消化道发育逐渐完善，消化道内细菌数量及菌群也整体渐趋平稳。

2.2   方斑东风螺养殖环境理化因子的变化

监测期间养殖环境主要理化因子变化如图 2，水体温度为21.33~29.77℃，9月水温较高，11月中下旬呈急剧下降趋势；溶解氧质量浓度为6.32~9.04 mg/L，随水温的降低，溶解氧含量升高，二者呈现一定负相关关系(P < 0.05)；盐度为27.83~33.73，其中9月变化较大，10月呈现下降趋势而后逐渐上升；pH为6.86~8.01，其变化与盐度呈现一定的相关性；水体中的氨氮及亚硝酸盐氮质量浓度变化分别为110.73~568.81 μg/L、7.33~34.70 μg/L，亚硝酸盐氮的变化较氨氮小，整体较稳定。底沙中的总氮、总磷的变化分别为0.27~0.56 μg/g、1092.17~2568.26 μg/g。东风螺养殖池中营养盐含量比高位池虾养殖水^[15]、大鹏澳养殖区柱状沉积物^[16]等的结果均低，东风螺在生产上常采用铺沙流水式养殖，这种养殖方式加快了水体流动和交换，促进与底沙之间的物质交流，减弱了营养盐的富集作用。

图  2  养殖环境温度、溶解氧、盐度、pH及营养盐随时间的变化

Fig.  2  Changes of temperature, dissolved oxygen, salinity, pH and major nutritive salt in aquaculture environment with time

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2.3   理化因子与细菌数量的相关性分析

方斑东风螺养殖环境及消化道细菌数量与理化因子的Pearson相关性系数见表 1，水环境中总细菌数量与溶解氧呈显著负相关(P< 0.05)，弧菌数量与总磷呈显著负相关(P< 0.05)；底沙弧菌数量与各理化因子无明显相关性，表明底质中细菌数量变动较为复杂。该流水式养殖中一些浮游细菌易形成菌膜附着于砂子或养殖生物表面，此外，环境中一些生物因素，如原生动物的捕食、噬菌体的感染等^[17-18]，均可能减弱细菌数量与理化因子的关系。温度通常是影响细菌生长的重要理化因子，但其对细菌分布的作用因不同海区、不同季节的生态系统而有所不同^[19]，在东风螺养殖生态系统中，水体及底沙弧菌、总细菌与温度无明显相关性。

表  1  方斑东风螺消化道及养殖环境细菌数量与理化因子的Pearson相关系数

Tab.  1  The Pearson correlation coefficients of physical-chemical factors and bacteria quantity of both in Babylonia areolate Alimentarytractandits cultivationenvironment

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消化道异养菌及弧菌数量与亚硝酸盐氮均呈极显著正相关(P< 0.01)，与pH均呈显著负相关(P< 0.05)，异养菌数量与盐度呈极显著负相关(P< 0.01)，弧菌数量与盐度呈显著负相关(P< 0.05)。方斑东风螺养殖区属较高盐度养殖区，盐度越高，其消化道细菌数量越少，该结果与Yu^[20]等研究牡蛎及蛤蜊体内弧菌与盐度的关系结果较一致。盐度通常受海区气候的影响，当其变化超出养殖动物自身对渗透压的调节能力时应引起警惕，并采取有效措施加以控制。相比于盐度，pH是东风螺养殖环境中更为重要的指标，水环境pH决定水体中许多化学与生物过程，是海水各项理化性质的综合结果，pH过低，水中CO₂含量增多，溶解氧含量降低，易导致腐生细菌的大量繁殖。

2.4   方斑东风螺消化道细菌数量与理化因子的模型拟合

将相关性分析中具有显著相关的变量进行回归模型拟合，根据可决系数R²的大小(0 < R² < 1，R²越大，表明拟合效果越好)及概率P< 0.05的原则选择相应的模型，结果表明，消化道异养菌、弧菌分别与亚硝酸盐氮的三次方程回归模型可决系数及概率分别为R²=0.83，P< 0.01和R²=0.84，P< 0.01，拟合效果最好；可分别表示为下列方程式1和方程式2：

东风螺消化道细菌主要来源于沉积环境及食物，沉积环境中菌群结构比较复杂，消化道内环境对定值的细菌具有长期的选择作用。根据本研究结果推测，方斑东风螺对亚硝酸盐氮可能有一定的富集作用，消化道内可能存在与环境中固氮微生物类似的异养菌群^[9]。

消化道异养菌及弧菌与盐度、pH均符合二次方程模型。水体总细菌与溶解氧、水体弧菌与总磷均符合增长模型，但以上的单因素回归模型拟合可决系数较低(R² < 0.5，P< 0.05)，拟合效果不理想，表明二者之间存在复杂的非线性关系，简单的线性模型无法准确表述。

2.5   方斑东风螺养殖环境要素的主成分分析及其时间分布特征

2.5.1   方斑东风螺养殖环境要素的主成分分析

应用z-score标准化处理数据，经对KMO(取样足够度的Kaiser-Meyer-Olkin度量)计算，其值为0.565>0.5，表明数据可以做主成分分析，经Bartlett球形度检验，近似卡方值为217.666，P< 0.01，表明因子变量相关性较强，足够为主成分分析提供合理的基础。

主成分的确定采用特征值大于1的标准，一共有5个主成分，方差贡献率累计达到74.84%，具体结果如下表 2所示。第一主成分主要表征螺消化道内微生物数量与水体营养盐、盐度、pH，其中亚硝酸盐氮是影响东风螺消化道内异养菌及弧菌数量的首要理化因子，对整个养殖系统的影响较大，盐度、pH在该系统中也具有重要意义；第二主成分主要表征水环境中的溶解氧、温度及弧菌，其中溶解氧与温度所占的权重系数较大，在该系统中的作用也不容忽视；第三主成分主要表征底沙弧菌与总氮，第四主成分表征水体总细菌，第五主成分主要表征总磷。

表  2  方斑东风螺养殖环境要素的主成分分析

Tab.  2  Principal component analysis of Babylonia areolate aquaculture environmental elements

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亚硝酸盐是硝酸盐与铵盐相互转化过程中不稳定的中间产物，也是水质的主要污染成分，其对养殖动物的毒害受盐度、pH、溶解氧等许多理化因子的制约，且受个体发育水平和体质的影响。东风螺对pH较敏感，其最适pH为8.0~8.4，本试验所监测的水环境pH偏低，pH越低，消化道内细菌数量越多，一些致病微生物量达到一个阈值时，便极易引起养殖动物病害爆发，且长期处于偏低的pH环境中会使机体的摄食明显下降，并处于麻痹状态，自我调节能力下降，更易感染病原微生物并形成恶性循环。这种通过降低养殖动物生理机能、调节病原微生物的感染能力及与养殖动物相互作用的机理，与海洋酸化对海洋动物病害爆发的影响机理类似^[9]。温度、pH、盐度和溶解氧不仅影响生物的生理活性，还会影响环境中物质的转化，已经发现亚硝酸盐的毒性与盐度、pH也有密切关系^[21]。

2.5.2   方斑东风螺养殖环境要素的时间分布特征

运用分类主成分分析法，实现了对监测期间方斑东风螺养殖生态系统各要素在时间上的分布特征描述，结果如图 3所示。受海南地区秋季气温的影响，方斑东风螺养殖系统在秋冬季分别呈现不同的环境主导因子，9月至11月中旬养殖水温基本维持在25℃以上，养殖动物及细菌代谢活动旺盛，温度、氨氮对水体细菌及弧菌的影响较明显，亚硝酸盐氮对螺消化道异养菌及弧菌、底沙弧菌的影响较明显，是环境的主导因子；冬季时，养殖系统受溶解氧含量的影响较明显，自11月下旬起，养殖系统水温逐渐下降，水体溶解氧含量迅速升高，加快了环境中好氧微生物的繁殖和分解代谢。

图  3  方斑东风螺养殖不同时期的综合得分及环境因子载荷

1.图中数字1~9表示9月的3次监测，10~18表示10月的3次监测，19~27表示11月，28~36表示12月；2.向量长度的平方表示该变量的方差贡献，各对象的坐标表示该对象在第一、二主成分的综合得分，从一个对象向分量载荷向量作垂线，交点的数值就是该对象在该变量上的表现值

Fig.  3  The spot of the first and second principal component scores and environmental factor loading

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3   结论

(1) 秋冬季东风螺养成期水体总细菌、弧菌数量分别为4.8×10⁴~3.8×10⁵ cells/mL、2.1×10²~1.2×10⁴ CFU/mL，底沙弧菌数量为6.0×10⁴~1.9×10⁶ CFU/g；东风螺消化道异养细菌、弧菌数量分别为4.3×10⁴~5.9×10⁶ CFU/g、2.0×10²~7.5×10⁵ CFU/g，二者数量波动呈极显著正相关(P< 0.01)。

(2) 方斑东风螺养殖水体温度为21.33~29.77℃，溶解氧质量浓度为6.32~9.04 mg/L，盐度为27.83~33.73，pH为6.86~8.01，氨氮及亚硝酸盐氮质量浓度变化分别为110.73~568.81 μg/L、7.33~34.70 μg/L，底沙总氮、总磷的变化分别为0.27~0.56 μg/g、1092.17~2568.26 μg/g。

(3) 相关性分析显示，水环境中总细菌数量与溶解氧呈显著负相关(P< 0.05)，弧菌数量与总磷呈显著负相关(P< 0.05)；底沙弧菌数量与各理化因子无明显相关性。消化道异养菌及弧菌数量与亚硝酸盐氮均呈极显著正相关(P< 0.01)，与pH均呈显著负相关(P< 0.05)，异养菌数量与盐度呈极显著负相关(P< 0.01)，弧菌数量与盐度呈显著负相关(P< 0.05)。

(4) 螺消化道异养菌、弧菌分别与亚硝酸盐氮符合三次方程回归模型，拟合效果较好；细菌数量与其他理化因子之间存在复杂的非线性关系，简单的线性模型无法准确表述。

(5) 主成分分析显示，9月至11月中旬，温度、氨氮对水体细菌及弧菌的影响较明显，亚硝酸盐氮对螺消化道异养菌及弧菌、底沙弧菌的影响较明显；冬季时，养殖系统受溶解氧含量的影响较明显。

(6) 亚硝酸盐、盐度、pH与消化道内异养菌及弧菌的关系密切，在养殖过程中需加强对这3个理化指标的监测的控制。