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Volume 40 Issue 1
Jan.  2021
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Preliminary study on the molecular signaling regulation mechanism in Rhopilema esculentum polyps strobilation induced by low temperature

  • Received Date: 2019-11-15
    Accepted Date: 2020-01-15
  • The life cycle of Rhopilema esculentum involves pelagic medusa and benthic polyp. Asexual reproduction is the main reproduction method of R. esculentum. As one of the asexual reproductions, the strobilation is the only way to transform polyps to medusae, which is mainly regulated by temperature. In order to investigate the effects of low temperature induction and the molecular regulation mechanism in the strobilation, R. esculentum polyps were cultured at low temperature for a short period, and the transcriptome differences between the low temperature group and control group were compared and analyzed. Results showed that there were 1655 differential expressed genes in the strobilation, which involved in TGF-β (transforming growth factor beta), MAPK (mitogen-activated protein kinase), Wnt (wingless-int) and Cell Cycle signaling pathways. Under the induction of low temperature, the above signaling pathways responded, but the Wnt signaling pathway was inhibited and the other three pathways were activated. This study preliminarily demonstrates the molecular regulation pathways involved in low temperature-induced R. esculentum polyps, which provides a help for further investigation of molecular regulation mechanism in strobilation of R. esculentum.
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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Preliminary study on the molecular signaling regulation mechanism in Rhopilema esculentum polyps strobilation induced by low temperature

  • 1. Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao 266100, China
  • 2. College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China
  • 3. College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao 266003, China
  • 4. Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071, China

Abstract: The life cycle of Rhopilema esculentum involves pelagic medusa and benthic polyp. Asexual reproduction is the main reproduction method of R. esculentum. As one of the asexual reproductions, the strobilation is the only way to transform polyps to medusae, which is mainly regulated by temperature. In order to investigate the effects of low temperature induction and the molecular regulation mechanism in the strobilation, R. esculentum polyps were cultured at low temperature for a short period, and the transcriptome differences between the low temperature group and control group were compared and analyzed. Results showed that there were 1655 differential expressed genes in the strobilation, which involved in TGF-β (transforming growth factor beta), MAPK (mitogen-activated protein kinase), Wnt (wingless-int) and Cell Cycle signaling pathways. Under the induction of low temperature, the above signaling pathways responded, but the Wnt signaling pathway was inhibited and the other three pathways were activated. This study preliminarily demonstrates the molecular regulation pathways involved in low temperature-induced R. esculentum polyps, which provides a help for further investigation of molecular regulation mechanism in strobilation of R. esculentum.

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  • 水母是海洋刺胞动物门中最常见的种类之一,其中某些大型钵水母具有重要的经济价值,在海洋渔业中占据着重要的地位[1]。海蜇(Rhopilema esculenta Kishinouye)隶属于刺胞动物门(Cnidaria)、钵水母纲(Scyphozoa)、根口水母目(Rhizostomeae)、根口水母科(Hizostomadae)、海蜇属(Rhopilema[2]。食用价值及潜在的药用价值使海蜇成为我国重要的渔业资源之一。自20世纪90年代以来,为补充海蜇的自然资源,多地进行了增殖放流,但由于海蜇对环境适应能力较差,其资源匮乏的现状并没有得到明显改善[3]

    海蜇生活史由无性繁殖的螅状体世代和有性繁殖的水母体世代组成的。海蜇无性繁殖方式包括足囊生殖和横裂生殖,其中横裂生殖是海蜇螅状体世代向水母体世代转变的唯一途径,也是决定海蜇种群大小的关键过程。横裂生殖的发生可由温度变化、内在节律以及外在环境中的化学信号引起[4-6]。研究表明,低温条件不仅能提高螅状体的成活率,还能促使体型较大的旧螅状体生长一段时间后发生横裂生殖,同时优化低温维持时长和低温程度可以提高海蜇螅状体横裂生殖的效率[7-9]。目前,关于海蜇横裂生殖分子调控机制研究的成果已经陆续发表,例如,周春娅等研究发现,Wnt5是调控海蜇横裂生殖的重要因子[10];骆晓蕊等研究发现,Notch基因在螅状体、横裂体、碟状体以及水母体阶段皆有不同程度的表达,并且在螅状体阶段的基因表达量是横裂体阶段的1.85倍[11];Ge对海蜇(R. esculentum)不同生长阶段的个体进行转录组测序,获得了参与海蜇横裂生殖的特异性基因簇[12]。上述文献为进一步研究海蜇横裂生殖的分子机制提供了新的视角。

    本研究针对海蜇螅状体进行短期低温培养,从转录水平上分析比较了低温诱导组和对照组螅状体转录组的差异,探究了低温诱导对海蜇螅状体横裂生殖的影响及横裂生殖过程中的分子调控机制,梳理了参与温度调控海蜇螅状体横裂生殖的信号转导通路。本研究为更深入地了解海蜇螅状体横裂生殖的分子调控机制奠定了基础,以期为海蜇资源补充和刺胞动物暴发性增殖研究提供参考。

  • 1.   材料与方法

      1.1.   海蜇螅状体培养

    • 海蜇螅状体由中国水产科学研究院黄海水产研究所提供。螅状体附着于聚乙烯波纹板上。培养条件为温度(18±1)℃,培养海水盐度为32,pH为7.5,自然光照条件,每3 d进行足量投喂,投喂饵料为卤虫(Artemia nauplius)无节幼虫,培养1个月后进行后续实验。

      实验前,将聚乙烯波纹板剪成小板并剔除板上生长状态不好的海蜇螅状体,每块板上保留50只左右的螅状体。对照组分别于第1 d、第3 d投喂一次卤虫,在室温下培养7 d后取样;低温组于4 ℃低温培养箱中培养7 d(正常投喂),再放置室温(18 ℃)培养7 d(仅第2 d投喂一次)后取样(以免后期投喂的卤虫对后续实验造成影响)。取样时,每组随机取12只正在进行横裂的螅状体置于冻存管中,并以液氮保存,用于后续实验。

    • 1.2.   样本总RNA提取和文库构建

    • 采用Trizol方法提取海蜇螅状体总RNA[13],用琼脂糖凝胶电泳和Agilent 2100分析检测总RNA样品的完整性。待样品检查合格后进行文库构建和库检,库检合格后上机测序。

    • 1.3.   质量控制和转录本拼接

    • 原始测序序列通过测序数据质量评估得到过滤后的序列(clean reads),之后采用Trinity对clean reads进行拼接,将得到的转录本序列用作后续分析的参考序列。选取每条基因中最长的转录本作为Unigene进行后续分析。

    • 1.4.   基因功能注释和差异基因富集分析

    • 将转录组数据进行各数据库(Nr、Nt、Pfam、KOG、Swiss-prot、KEGG和GO)基因功能分析,并对获得的差异基因进行GO富集和KEGG富集分析。

    2.   结果与讨论

      2.1.   海蜇螅状体横裂生殖发生情况的统计

    • 根据公式(1)分别计算低温处理组和对照组的螅状体横裂率(见图1[14]。两组的海蜇螅状体都从第4 d开始发生横裂,第5 d横裂率分别为5.7%和6.4%,第7 d对照组的横裂率为10.6%,而此时低温组的横裂率为25.7%,是对照组的2.4倍,证明低温可促进海蜇横裂生殖。横裂率的计算公式如下:

      Figure 1.  Strobilation of Rhopilema esculentum polyps in treatment of low temperature

    • 2.2.   转录本生物信息学分析

      2.2.1.   测序与拼接
    • 螅状体总RNA提取后,成功构建了低温组和对照组的两个转录组文库,结果统计如表1所示,共得到87197条Unigenes用于后续分析。

      样品 原始序列条数 过滤后
      序列条数
      过滤后序列
      总长度/G
      GC含量/(%)
      对照组 48430410 46168634 6.89 43.85
      低温组 47653686 45720280 6.86 41.74

      Table 1.  High throughput sequencing results

    • 2.2.2.   基因功能注释
    • 七大数据库的基因功能注释成功率统计如图2所示。Nr数据库比对成功的序列最多,占总Unigenes的29.47%,其中比对成功率最高的物种是普通水螅(Hydra vulgaris)。其次是GO与PFAM数据库,分别有27.87%和27.44%的Unigenes注释成功。被注释到Nt数据库的Unigenes最少,仅占总Unigenes的9.9%。

      Figure 2.  Successful rates of gene annotation

    • 2.2.3.   差异基因KEGG富集分析
    • 在本研究中共发现1655个差异基因。与对照组相比,低温处理组有883个基因的表达水平出现显著上调,772个基因的表达水平下调。差异基因的KEGG富集分析结果如图3所示。图3包括了显著富集的20条pathway条目,其中富集最显著的信号通路包括蛋白质的消化和吸收、胰腺分泌、精氨酸和脯氨酸代谢、花生四烯酸代谢等通路。

      Figure 3.  KEGG enrichment analysis of differentially expressing genes

    • 2.2.4.   与无性繁殖相关的信号通路和关键基因
    • 选取KEGG富集到的与细胞增殖分化调控相关的TGF-β、MAPK、Wnt和Cell cycle 4条信号通路进行分析,富集到各个信号通路差异基因的详细信息如表2所示。

      信号通路UniGenesKO序号基因缩写名称Lf
      TGF-β信号通路 c46554_g1 K04667 INHB inhibin, beta −1.6
      c50494_g1 K04677 SMAD6/7 mothers against decapentaplegic homolog 6/7 −1.7
      c52959_g1 K04667 INHB thrombospondin 1 −1.9
      MAPK信号通路 c40451_g1 K04348 PPP3C serine/threonine-protain phosphatase 2B catalytic subunit −1.2
      c22780_g1 K03283 HSPA1/8 heat shock 70KDa protein 1/8 1.5
      c60974_g1 K04437 FLNA filamin −1.5
      c54862_g2 K04439 ARRB beta-arrestin −1.6
      c57676_g1 K04353 RAP1A ras-related protein Rap-1A 1.5
      c49179_g1 K04459 DUSP dual specificity MAP kinase phosphatase −2.1
      c48018_g1 K04448 JUN transcription factor AP-1 −1.4
      c52206_g1 K04409 PAK1 p21-activated kinase 1 −1.5
      c57687_g2 K04360 NTPK neurotrophic tyrosine kinase receptor type −1.2
      Wnt信号通路 c55638_g2 K04511 PRICKLE prickle −3.2
      c50259_g1 K01645 CER1 cerberus 1 toxin substrate 1 4.9
      c48018_g1 K04448 JUN transcription factor AP-1 −1.4
      c58440_g1 k03068 LRP5/6 low density lipoprotein receptor-related protein 5/6 1.1
      c40451_g1 K04348 PPP3C serine/threonine-protein phosphatase 2B catalytic subunit −1.2
      Cell Cycle通路 c47501_g1 K03348 APC1 anaphase-promotion complex subunit 1 2.0
      c46784_g1 K06630 YWHAE 14-3-3 protein beta/theta/zeta −1.6

      Table 2.  Differential genes and their changes of expressing level in each signal pathway in the treatment of low temperature

      (1)TGF-β信号通路

      TGF-β是一类影响自分泌和旁分泌细胞的分泌蛋白,在细胞增殖和凋亡等过程中发挥着重要作用。在本研究结果中,富集在TGF-β信号通路中的差异基因有3个:SMAD6/7和两种INHB(见图4),其中SMAD6和SMAD7是TGF-β信号通路中的抑制性SMAD,它们在SMAD依赖性的TGF-β信号通路中负反馈调节R-SMADs和co-SMADs的活性[15]。INHB(Activin)还可以通过抑制TGF-β信号分子与受体结合来促进TGF-β信号通路的激活与传递。它们的表达水平下调有利于TGF-β信号通路的激活与传递,进而调控细胞的增殖分化。骆晓蕊通过RACE和RT-PCR技术克隆了室温培养下海蜇TGF-β/SMADs途径中TβR-I的cDNA全长,分析了TβR-I的mRNA在海蜇不同生长阶段表达水平的变化,结果发现该基因在水母体、螅状体、横裂体和碟状体4个阶段皆有表达,尤其在横裂体阶段的表达量最高,表明TβR-I基因可以调控海蜇横裂生殖过程[16]。本实验虽然证明了TGF-β信号通路参与调控海蜇横裂生殖过程,但是该通路中经典信号因子TGF-β及其受体TβR-I并没有出现差异表达,可能是该培养条件对海蜇横裂生殖的诱导力度较小,也可能是低温培养抑制了其表达活性。总体而言,TGF-β信号通路被激活以调控海蜇螅状体的横裂过程。

      Figure 4.  TGF-β signaling pathway in Rhopilema esculentum transcriptome

      (2)MAPK信号通路

      本研究中富集在MAPK信号通路的差异基因有9个,JUN和FLNA等7种基因的表达水平下调,HSPA1/8和RAP1A两种基因的表达水平上调(见图5)。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)以及p38都是MAPK家族中的主要成员。JNK信号通路可通过两种机制激活,一种是通过MAP3K识别并激活MAP2K,进而使MAP2K识别并激活MAPK;另一种是通过一些支架蛋白组装成JNK信号传导模块[17]。研究表明,FLNA和ARRB可能是支架蛋白,参与JNK模块的组建[18],而支架蛋白可以用来连接MAPK模块成员[19]。在本实验结果中,FLNA和ARRB的下调抑制了激活JNK途径的第二种机制,同时PPP3C的下调会造成NFAT-2以及NFAT-4的积累,而NFATs是调控细胞分化的关键调节因子[20],因而这将有利于细胞分化过程的进行。JUN有碍于体细胞重编程,其表达水平下调有利于细胞增殖。研究结果显示,MKP基因表达水平下调,由于该基因对p38蛋白以及JNK通路具有抑制作用,其表达水平下调有利于激活p38 MAPK信号通路和JNK信号通路,进而调控细胞周期。大部分差异基因集中在JNK MAPK信号通路中,说明该信号通路相对于p38 MAPK信号通路对低温的响应更加敏感,而支架蛋白的下调证明了JNK主要通过第一种机制来调控海蜇的横裂过程。

      Figure 5.  JNK and p38 MAPK signaling pathway in Rhopilema esculentum transcriptome

      (3)Wnt信号通路

      Wnt信号通路可能是调控早期多细胞生物轴向分化过程的重要枢纽。Wnt/β-catenin信号通路可调控后生动物的体轴发育 [21]。Chera等曾提出,不同类型的损伤会诱导Hydra头部产生不同的再生模式,但其仍然会聚集在中央效应器Wnt3上[22]。除此之外,Wnt信号通路在螅状体的无性生殖过程中具有重要的调控作用。Philipp等的研究结果显示,Wnt 5、Wnt 8、Frizzled 2和Dsh基因仅在出芽部位和触手部位表达,证明了Wnt信号途径调控螅状体的出芽生殖过程[23]。周春娅探究了Wnt信号通路中的关键基因在室温培养下的海蜇不同生长阶段中的表达水平差异,结果发现Wnt4、Wnt5以及Frizzled1基因在海蜇的4个阶段都有表达,并且都在横裂体阶段的表达量最高,表明Wnt信号途径中这3个基因都参与了海蜇横裂生殖的调控[24]。但是在本实验中这些基因并没有出现差异表达,其原因可能是此诱导条件不足以使Wnt信号途径中的基因出现差异表达,也可能是低温培养条件抑制了这些基因的表达。本研究结果显示,富集在Wnt信号通路中的差异基因有5个,分别为PRICKLE、CER1、JUN、LRP5/6和PPP3C(见图6)。其中,出现在经典Wnt信号通路中的差异基因有LRP5/6和JUN,分别上调和下调表达;LRP5/6能够与Frizzled受体相结合共同介导Wnt信号通路,其表达水平的上调会引起该通路的传递信号增强;CER1能够抑制Wnt与Frizzled受体结合,因此CER1表达水平的上调反而会削弱Wnt信号传递;JUN表达水平出现下调,说明经典Wnt信号通路在海蜇螅状体横裂生殖过程中的调控作用并不明显。

      Figure 6.  Wnt signaling pathway in Rhopilema esculentum transcriptome

      (4)Cell Cycle信号通路

      海蜇螅状体横裂生殖过程依靠的是细胞的分裂和分化,细胞周期信号通路具有重要的调控作用。本研究中富集在Cell Cycle信号通路中的差异基因有两个:APC1和YWHAE,表达水平分别为上调和下调(见图7)。在细胞周期信号通路中,CDC25是有丝分裂过程中重要的激酶,YWHAE与活化后的苏/丝氨酸激酶CHK1结合后会磷酸化CDC25,磷酸化的CDC25可以阻碍细胞周期由G2期向M期转化[25]。APC1是后期促进复合物(APC)的10个亚基之一,在细胞分裂的中期—后期转变中起作用。而APC是一种E3泛素连接酶,可调控细胞周期 [26]。本实验中,YWHAE表达水平的下调和APC表达水平的上调,均有利于促进细胞增殖。

      Figure 7.  Cell Cycle signaling pathway in Rhopilema esculentum transcriptome

    3.   结 论
    • 通常,环境刺激会引发细胞内多条信号通路响应,并且不同途径之间存在交叉调节。研究结果显示,经过短期的低温诱导后海蜇横裂发生率明显升高,说明低温对海蜇的横裂生殖过程有明显的诱导作用,并且在横裂生殖过程中TGF-β、MAPK、Wnt和Cell Cycle信号途径均有所响应,但响应的程度有所差异。其中TGF-β、MAPK和Cell Cycle信号通路在低温的诱导下均被激活,正向调控海蜇螅状体的横裂过程,而Wnt信号通路被抑制,负向调控海蜇螅状体的横裂过程。本研究可为深入揭示海蜇横裂生殖的分子调控机制提供参考。

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